秦 洁，龚光明 ，杜 英，孙石磊，杨 璇，朱 沙，轩小燕，刘萍萍，王 娜，许予明

1)郑州大学第一附属医院神经内三科 郑州450052 2)郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室 郑州450001

#通讯作者，男，1973年12月生，博士，讲师，研究方向:抗感染免疫、干细胞与再生医学，E-mail:gmgong@zzu.edu.cn

结核病仍然是世界上主要致死性疾病之一［1-2］，近期世界范围内出现大量致死性多重耐药菌株。造成防治结核分枝杆菌感染进展缓慢的主要原因是对结核分枝杆菌的致病机制以及人类免疫反应的具体机制尚不十分清楚。阐明卡介苗(BCG)感染引发机体产生的免疫反应机制将非常有利于发现新的防治结核分枝杆菌感染的有效措施［1，3］。作者最近的研 究 发 现［4-7］，CD4+CD25+调 节 性T 淋 巴 细 胞(CD4+CD25+regulatory T cell，Tregs)可 以 抑 制Vγ2Vδ2 T 淋巴细胞的体外抗原特异性和非特异性扩增，对人类抵抗结核分枝杆菌感染的免疫反应有负调节作用。灵长类动物因为具有和人类非常接近的生物学特征，常被用来作为研究人类感染性疾病的珍贵动物模型［8-10］。作者观察了中国猕猴抗结核分枝杆菌感染过程中Tregs 对效应性T 淋巴细胞产生的抗结核杆菌特异性免疫反应的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6 只雄性中国猕猴，由美国芝加哥伊利诺伊州立大学生物资源中心提供，3 个月内接受过一次静脉注射106BCG。年龄3～6 岁，体质量3.1～6.9 kg。动物饲养和实验方法均经该校动物关怀与使用委员会批准。

1.2 主要抗体、试剂和仪器设备 纯化鼠抗人CD28、CD3 及PE-Cy7 和PB 融合的CD3 抗体为BD Pharmingen 公司产品，PB 融合的鼠抗人CD4、PECy7 融合的CD8 为eBioscience 公司产品，纯化或FITC 融合的TCR Vγ2 抗体、纯化或FITC 融合的TCR Vδ2 抗体购自Endogen 公司，APC/PE 融合的山羊抗鼠IgG 单抗购自Biolegend 公司，CFSE 细胞扩增试剂盒(C34554)购自Invitrogen/Molecular Probes 公司，灵长类非人动物Tregs 分离试剂盒(130-092-984)、Anti-mouse IgG 磁珠、MACS Multi-Stand(130-042-303)、LD(130-042-901)和MS(130-042-201)分离柱、MiniMACS(130-042-102)和MidiMACS(130-042-302)分离单位均为Miltenyi Biotec 产品。流式细胞仪Summit V4.3 分析软件均为美国DakoCytomation 公司产品。

1.3 细胞分离 ①外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分离:采用密度梯度离心法从15 mL EDTA 抗凝的猕猴外周血液中分离PBMCs。②Tregs 的分离:从PBMCs 中阴性分选CD4+T 淋巴细胞，再从CD4+T 淋巴细胞中阳性分选Tregs。具体分选方法参见试剂说明书。

1.4 CFSE 和PKH26 标记细胞 CFSE 标记去除Tregs 的PBMCs。PKH26 红标记Tregs。具体标记方法参见试剂说明书。

1.5 Tregs 抑制功能分析-CFSE 基础的细胞扩增分析实验 具体方法参见文献［4］。将CFSE 标记的、去除Tregs 的PBMCs 以2×105/孔的密度接种96 孔板，分6组。①空白对照组:除了CFSE 标记的PBMCs 外无任何添加。②CD3/CD28组:含纯化鼠抗人CD3 和CD28 单克隆抗体(5 μg/L)。③PPD组:含PPD(15 L)。④Tregs组:将纯化并经PKH26标记的Tregs 以2×105/孔的密度接种以上含CFSE标记的PBMCs 中，即①+④。⑤Tregs +CD3/CD28组:②+④。⑥Tregs +PPD组:③+④。每孔终体积为0.2 mL，用含有体积分数10% FBS、50 U/mL青霉素、50 mg/L 链霉素的RPMI 1640 细胞培养液轻轻地混匀完全，37℃、5%CO2、饱和湿度下培养7 d。培养7 d 后，收集细胞进行CD3、CD4、CD8、Vδ2荧光抗体染色。24 h 内使用流式细胞仪对经过荧光抗体染色的细胞进行检测。使用Summit V4.3 软件对CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+Vδ2+T 淋巴细胞的CFSE 信号强度进行分析，分析时根据SSC/FSC 和FSC/Pulse Width 点阵对PBL 设门，并排除PKH26+细胞的干扰。细胞扩增比例以CFSEdim细胞所占CFSE+细胞的百分比计算。

1.6 统计学处理 使用GraphPad 软件，采用单因素方差分析和LSD-t 检验比较各组CD4+、CD8+和Vγ2Vδ2 T 淋巴细胞扩增的比例，检验水准α=0.05。

2 结果

各组CD4+、CD8+和Vγ2Vδ2 T 淋巴细胞的扩增比例见表1。

表1 各组CD4+、CD8+和Vγ2Vδ2 T 淋巴细胞的扩增比例 %

3 讨论

该研究中，作者采用一种敏感的、多用途的CFSE 基础的实验方法对Tregs 的抑制功能进行体外分析［9］。CFSE 是一种无色无荧光的染料，当和被染色细胞在37℃条件下共同孵育时，CFSE 被细胞摄入，从而均匀地散布在胞质中。CFSE 被胞质中的脂酶分解成荧光化合物，这种荧光化合物能和细胞内的胺类结合形成稳定的化合物，随细胞分裂而存在于子代细胞中，只是荧光强度有所减弱。因此，利用CFSE 荧光强度减弱的特性，可以用于检测CFSE 标记细胞的扩增情况。

通过CFSE 基础的流式细胞术分析，作者证实中国猕猴Tregs 对Vγ2Vδ2 T 淋巴细胞以及CD4+T淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞产生的PPD 抗原特异性和抗原非特异性扩增有强大的体外抑制功能。Tregs 不仅抑制传统观点认为的在抗结核感染免疫中发挥重要作用的CD4+T 淋巴细胞产生的PPD 抗原特异性的体外扩增，而且抑制CD8+T 淋巴细胞［10］和Vγ2Vδ2 T 淋巴细胞［7］产生的PPD 抗原特异性的体外扩增。Tregs 具有体外抑制CD8+T 淋巴细胞和Vγ2Vδ2 T 淋巴细胞产生的抗结核分枝杆菌抗原特异性扩增的功能，一方面表明最近人们越来越认识到CD8+T 淋巴细胞［10］和Vγ2Vδ2 T 淋巴细胞［7］在机体产生的抗结核分枝杆菌感染免疫中的重要作用; 另一方面，这些证据表明Tregs 对在BCG 感染过程中共同发挥作用的、包括CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞［10］和Vγ2Vδ2 T 淋巴细胞［7］在内的广泛效应性/记忆性细胞池，都有着强大的负性调节作用。Tregs 在机体产生抗结核分枝杆菌感染免疫过程中，可能不仅控制传统的CD4+T淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞［10］介导的抗结核分枝杆菌感染免疫，而且控制Vγ2Vδ2 T 淋巴细胞介导的抗结核分枝杆菌感染免疫［7］。

总之，该研究结果表明，Tregs 可抑制CD4+、CD8+和Vγ2Vδ2 T 淋巴细胞介导的抗结核杆菌特异性免疫反应。

［1］Huang D，Qiu L，Wang R，et al.Immune gene networks of mycobacterial vaccine-elicited cellular responses and immunity［J］.J Infect Dis，2007，195(1):55

［2］Li L，Lao SH，Wu CY.Increased frequency of CD4(+)CD25(high)Treg cells inhibit BCG-specific induction of IFN-gamma by CD4(+)T cells from TB patients［J］.Tuberculosis (Edinb)，2007，87(6):526

［3］Soysal A，Millington KA，Bakir M，et al.Effect of BCG vaccination on risk of Mycobacterium tuberculosis infection in children with household tuberculosis contact:a prospective community-based study［J］.Lancet，2005，366(9495):1443

［4］龚光明，秦洁，轩小燕，等.中国猕猴CD4+CD25+调节性T 细胞抑制Vγ2Vδ2 T 细胞的体外扩增［J］.郑州大学学报:医学版，2011，7(4):529

［5］Chen X，Zhou B，Li M，et al.CD4(+)CD25(+)FoxP3(+)regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease［J］.Clin Immunol，2007，123(1):50

［6］Scott-Browne JP，Shafiani S，Tucker-Heard G，et al.Expansion and function of Foxp3-expressing T regulatory cells during tuberculosis［J］.J Exp Med，2007，204(9):2159

［7］Li L，Wu C.CD4+CD25+Treg cells inhibit human memory {gamma}{ delta} T cells to produce IFN-{ gamma} in response to M.tuberculosis antigen ESAT-6［J］.Blood，2008，111(12):5629

［8］Shen Y，Zhou D，Qiu L，et al.Adaptive immune response of Vγ2Vδ2+T cells during mycobacterial infections［J］.Science，2002，295(5563):2255

［9］Gong G，Shao L，Wang Y，et al.Phosphoantigen-activated Vγ2Vδ2 T cells antagonize IL-2-induced CD4+CD25+Foxp3+T regulatory cells in mycobacterial infection［J］.Blood，2009，113(4):837

［10］Chen CY，Huang D，Wang RC，et al.A critical role for CD8 T cells in a nonhuman primate model of tuberculosis［J］.PLoS Pathog，2009，5(4):e1000392