田文礼， 赵亚周， 方小明， 高凌宇， 彭文君

(中国农业科学院蜜蜂研究所农业部授粉昆虫生物学重点开放实验室/国家蜂产品加工技术研发中心，北京 100093)

高效液相色谱法检测蜂花粉中总维生素C

田文礼， 赵亚周， 方小明， 高凌宇， 彭文君

(中国农业科学院蜜蜂研究所农业部授粉昆虫生物学重点开放实验室/国家蜂产品加工技术研发中心，北京 100093)

为了得到一种效果较好的测定蜂花粉中总维生素C含量的方法，本文采用高效液相色谱法对油菜蜂花粉进行总VC的定性与定量分析，从结果的稳定性、精密度和重现性三方面对其进行了考量.结果发现，总VC含量在12.70～200.00 μg范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系，且回收率在95.71% ～98.60%，相对标准偏差为1.05%;稳定性实验的相对标准偏差为2.12%，精密度实验的相对标准偏差为1.1%;最终测得油菜蜂花粉样品的总VC平均含量为36.99 mg·(100 g)－1，相对标准偏差为1.43%.本研究所建立的HPLC测定蜂花粉中总VC含量的方法简单快速、重现性好，可以较为准确的实现定性与定量分析.

高效液相色谱;蜂花粉;总维生素C

蜂花粉来源于大自然，是蜜蜂从显花植物(蜜源植物和粉源植物)的花蕊内采集的花粉粒，并加入其特殊腺体的分泌物、花蜜和唾液混合而成的一种不规则扁圆形颗粒物［1］.蜂花粉具有独特的天然保健、医疗及美容价值，被誉为“浓缩的天然营养库”.研究证实，蜂花粉中含有多种营养物质，其中包括23种氨基酸、14种维生素和30多种微量元素以及大量的活性蛋白、核酸、黄酮类化合物及其他活性物质［2－3］.蜂花粉的维生素种类和含量丰富，其中维生素C(vitamin C，VC)较为重要，其化学名为L-抗坏血酸，主要分为还原型VC、脱氢型VC和二酮古龙糖酸3种，广泛存在于蔬菜、水果等植物组织中，是人体新陈代谢所必需的营养物质［4］.

VC溶于水或乙醇中，不溶于油等有机溶剂，在水溶液中易被氧化，碱性条件下易分解，弱酸条件下较稳定.测定VC多依据其还原性质，主要方法有2，6-二氯靛酚滴定法、碘滴定法、钼蓝比色法、紫外分光光度法、2，4-二硝基苯肼法、高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)、荧光法以及电化学法等［5］.中华人民共和国供销合作行业标准——蜂花粉(GH/T 1014—1999)通用理化要求规定VC(含量大于4 mg·(100 g)－1)的测定方法依据GB/T 12392—蔬菜、水果及其制品中总VC的测定方法(荧光法和 2，4-二硝基苯肼法)［6］.但是，蜂花粉中总VC含量的测定如采用2，4-二硝基苯肼比色法，存在操作步骤繁琐、耗时长和平行样品间测定结果偏差较大等不足;而采用荧光法对空白样品的条件要求较高，且结果的重现性较差［7］.目前，关于采用HPLC法对蜂花粉中总VC含量的分析报道较少.本文拟建立一种利用高效液相色谱法测定蜂花粉中总VC含量的方法，以达到操作简单、易控制且重现性好的效果，可以广泛应用于实际生产中的质量检测，为开发利用蜂花粉中丰富的VC，提供一定的理论参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蜂花粉由北京中蜜科技发展有限公司提供.

偏磷酸-乙酸溶液:称取15 g偏磷酸，加入40 mL冰乙酸及250 mL水，加温，搅拌，使之逐渐溶解，冷却后加水至500 mL，于4℃冰箱保存7～10 d.

邻苯二胺溶液(200 mg/L):称取20 mg邻苯二胺，使用前用水稀释至100 mL.

VC标准溶液(1 mg/mL)(母液):准确称取50 mg VC，用偏磷酸-乙酸溶液溶于50 mL容量瓶中，稀释至刻度.

VC标准使用液(100 μg/mL):取10 mL VC标准液，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100 mL.

1.2 仪器与设备

Agilent1200型高效液相色谱仪，荧光检测器，Agilent1200色谱工作站;HY-2型调速多用振荡器，江苏省金坛市宏华仪器厂;AL-204型电子天平，Acculab公司.

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

蜂花粉样品经高速组织捣碎机处理，称取2 g加入50 mL偏磷酸-乙酸溶液中，振荡萃取30 min，过滤;向过滤液中加入1 g活性炭，用力振摇1 min，过滤.吸取2 mL滤液置于10 mL带盖试管中，在暗室内迅速向各管加入5 mL邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反应35 min，过微滤膜后备用.

1.3.2 色谱条件

色谱柱为Agilent TC-C18(4.6 mm×150 mm)，柱温为40℃，荧光检测器为激发光波长338 nm，发射光波长420 nm.流动相为甲醇/磷酸二氢钾溶液(40 mmol/L)=20/80(v/v);流速为1 mL/min.

2 结果与分析

2.1 定性分析

2.1.1 HPLC色谱图对比

VC标准品的HPLC图和蜂花粉样品的HPLC图分别如图1和图2.从图1和图2可以看出，VC标准品与蜂花粉样品中VC色谱峰的保留时间和峰型一致，分别在8.152 min和8.197 min出现，可以肯定HPLC能对蜂花粉中VC进行准确定性.

图1 VC标准品的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of VC standard

图2 蜂花粉样品的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of bee pollen samples

2.1.2 标准曲线及线性范围测定

精密称取 VC标准品 12.70，31.75，65.00，127.00，200.00 μg置于10 mL 容量瓶中，加偏磷酸-乙酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，配成标准工作液.用 HPLC进行测定，得到其线性方程为y=8.956x－0.397(R=0.999 6)(y为色谱峰面积，x为VC浓度).结合图3与线性方程中的线性相关系数可以看出，VC含量在12.70～200.00 μg范围内与色谱峰面积呈现良好的线性关系.

图3 VC标准曲线Fig.3 Calibration curve of VC

2.1.3 回收率实验

在底物中含有VC 743.65 μg的基础上，向其中添加不同量的标准品后，继续测试VC含量，并计算回收率(见表1).从表1可以看出，5次重复实验中，回收率在95.70% ～98.57%，并且相对标准偏差为1.05%.说明HPLC测试蜂花粉样品中的VC含量具有较高的准确性，数据比较可靠.

表1 VC回收率实验结果Tab.1 Recovery experiments of VC

2.2 定量分析

2.2.1 HPLC精密度实验

精密度是指在同一实验室中，同一工作人员采用同一台仪器，在较短时间间隔内，对样品平行测定.实验利用HPLC对油菜蜂花粉中的VC含量进行了5次实验，结果见表2，发现实验中所制备的油菜蜂花粉中 VC含量在36.24～37.18 mg·(100 g)－1，相对标准偏差为1.10%，说明本实验所采用的方法进行蜂花粉中VC含量测定，结果的精密度良好.

表2 VC含量精密度实验结果Tab.2 Precision experiments of VC content

2.2.2 HPLC稳定性实验

将油菜蜂花粉进行样品制备，经 0，1，2，3，4 和5 h时利用HPLC测定其VC含量(见表3)，各样品平行测定5次.所得结果的相对标准偏差为1.05%，说明由该样品制备方法得到的样品中VC含量在5 h内可以基本保持稳定.

表3 VC含量稳定性实验结果Tab.3 Stability experiments of VC content

2.2.3 蜂花粉中VC含量测定

称取油菜蜂花粉3份，各2 g，对其进行制备后，分别精密吸取20 μL，利用 HPLC进行 VC含量测定，每个样品平行测定5次，结果如表4.样品中VC含量平均值为36.99 mg·(100g)－1，相对标准偏差为1.43%.

表4 油菜蜂花粉中VC含量Tab.4 VC content of rape bee pollen

3 结论

研究建立了高效液相色谱法测定油菜蜂花粉中VC含量的方法，该方法操作简单，结果的精密度、稳定性和重现性好.可以实现油菜蜂花粉中VC的定性和定量分析，为蜂花粉中VC的开发利用提供参考.

［1］Gonzalez G，Hinojo M J，Mateo R，et al.Occurrence of mycotoxin producing fungi in bee pollen［J］.International Journal of Food Microbiology，2005，105(1):1-9.

［2］Paramas A M G，Barez J A G，Marcos C C，et al.HPLC-fluorimetric method for analysis of amino acids in products of the hive(honey and bee-pollen) ［J］.Food Chemistry，2006，95(1):148-156.

［3］Almeida-Muradian L B，Pamplona L C，Coimbra S，et al.Chemical composition and botanical evaluation of dried bee pollen pellets［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2005，18(1):105-111.

［4］Arrigoni O，De Tullio M C.The role of ascorbic acid in cell metabolism:between gene-directed functions and unpredictable chemical reactions［J］.Journal of Plant Physiology，2000，157:481-488.

［5］张昉，高蓉.维生素C检测方法研究进展［J］.中国卫生检验杂志，2009(2):457-460.

［6］中国蜂产品协会花粉专业委员会及科技委员会.GH/T1014—1999中华人民共和国供销合作行业标准—蜂花粉［S］.北京:中国标准出版社.

［7］林桂荣，郭泳，付亚文，等.新鲜果蔬维生素C测定方法研究［J］.北方园艺，1999(2):7-9.

(责任编辑:李 宁)

Determination of Total Vitamin C in Bee Pollen by HPLC Method

TIAN Wen-li， ZHAO Ya-zhou， FANG Xiao-ming， GAO Ling-yu， PENG Wen-jun
(Key Laboratory for Insect-Pollinator Biology，Ministry of Agriculture/National R＆D Center for Bee Product Processing，Institute of Apiculture，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100093，China)

To obtain an efficient method for determination of total vitamin C(VC)in bee pollen，highperformance liquid chromatography(HPLC)was employed and investigated for its stability，precision and repeatability in qualitative and quantitative analysis of total VC in bee pollen.As the results，total VC content and chromatogram peak area presented good linear correlation.The recoveries were 95.71%～98.60%with RSD 1.05%.The RSD of the stability and precision experiments were 2.12%and 1.1%respectively.Total VC content in rape bee pollen was 36.99 mg/100 g in average，and its RSD was 1.43%.In conclusion，HPLC can be used as a simple and fast method for qualitative and quantitative analysis of total VC in bee pollen.

high-performance liquid chromatography;bee pollen;total vitamin C

TS207.3;S896.4

A

1671-1513(2012)02-0035-04

2012-02-27

国家现代蜜蜂产业技术体系资助项目(NYCYTI-43-KXJ17);科研院所技术开发专项资金资助项目(2009EG134274);农业科技成果转化资金资助项目(2010GB23260588).

田文礼，助理研究员，硕士，主要从事功能食品与生物活性物质方面的研究;

彭文君，研究员，主要从事功能食品与生物活性物质方面的研究.通讯作者.