万宇平， 吴 鹏， 冯月君， 罗晓琴， 韩京朋

(北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206)

食品中磺胺类药物化学发光酶联免疫检测试剂盒的初步研究

万宇平， 吴 鹏， 冯月君， 罗晓琴， 韩京朋

(北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206)

在常规酶联免疫法的基础上，将磺胺类母核与牛血清白蛋白合成免疫抗原后免疫小鼠制得磺胺类单克隆抗体，并进一步优化抗体工作浓度、反应时间等实验参数，建立了一种简便、快速、精确的磺胺类残留一步式化学发光酶联免疫检测方法.结果表明该方法最佳检测范围为1.0～81.0 ng/mL，检测IC50达3.047 ng/mL，对猪肉的最低检测限为0.74 ng/g，可检出国际规定的SAs残留标准底限值以下的残留量.与常规ELISA方法相比，检测限和灵敏度基本一致，但反应时间缩短了60 min.证明采用一步式化学发光酶联免疫检测磺胺类残留可以大幅度缩减检测时间，符合快速检测的要求.

兽药;检测技术;磺胺类;化学发光酶联免疫法;试剂盒

磺胺类药物(sulfonamides，SAs)的基本结构为对氨基苯磺酰胺，具有芳氨基和磺酞胺基，多为两性化合物，药物具有一定酸性［1］.磺胺类药物的抑菌作用机理是磺胺类药物中能分解出对氨基苯磺酰胺，其分子的大小和形状与组成叶酸中的对氨基苯甲酸相近，化学性质也类似.由于细菌对二者缺乏选择性，大量的对氨基苯磺胺替代了对氨基苯甲酸而被细菌吸收，干扰细菌叶酸的合成而影响其生长繁殖，从而可抑制大多数革兰氏阳性菌和某些阴性菌.磺胺类药物应用较广，具有一定疗效的就有几十种［2］.

磺胺类药物在动物疾病的防治方面具有显著的疗效，例:针对动物的肠炎、乳房炎、肺炎、脑膜炎等疾病.因此磺胺类药物作为兽药和饲料添加剂，在食源性动物的饲养中被广泛应用［3］.同时，这类药物具有显著的毒副作用，影响人的泌尿系统功能，引起结晶尿、血尿、尿痛、尿少等症状，或产生一些皮炎、发热等过敏反应以及致癌性作用［4－5］.如果这类药物不按规定或要求使用与停药，动物体内的药物残留会随着食物链最终蓄积在人体内，从而影响人体的健康［6］.因此，国内外对磺胺类药物残留均有限量要求，我国以及美国、欧盟等国家规定动物性食品中总磺胺以及单个磺胺的最高残留限量(maximum residue limit，MRL)为 0.1 mg/kg，其中磺胺二甲基嘧啶(SM2)的 MRL 为 0.025 mg/kg［7］.

目前，针对磺胺类兽药残留的检测方法有薄层色谱(thin-layer chromatography，TLC)、高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法、液质联用(high performance liquid chromatography/mass spectrum，HPLC/MS)、气相色谱(gas chromatography，GC)、酶联免疫吸附(enzyme linked immunoassay，ELISA)和毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE) 法等［8－13］.由于复杂的仪器设备和繁琐的前处理过程，仪器分析方法不适合现场监控和大量样本的筛选，其中ELISA方法作为一种新型的动物源性食品中磺胺类药物残留筛选方法已被使用，并且ELISA法在稳定性和准确度方面存在着一定的局限性，大部分只能针对磺胺类其中一种或者少数几种药物进行检测，不利于磺胺类药物的全面检测［14－17］.

化学发光免疫检测方法具有特异性强、稳定快速、检测范围宽、操作简单、自动化程度高、试剂稳定且有效期长(6～18个月)等优点，其检测限比酶联免疫法和理化检测方法高几个数量级［18－19］.化学发光进口仪器与试剂性能较好，而国外的技术垄断导致化学发光仪、发光底物液和试剂盒价格居高不下，而且试剂或试剂盒与仪器相匹配，进口试剂常常不能在国产仪器中使用，造成化学发光免疫方法无法在基层普及.化学发光底物液是化学发光酶免疫检测方法的关键试剂，配制出低成本且性能良好，适合国产仪器使用的的发光底物液，可降低化学发光方法的使用成本，有利于在基层的普及.建立稳定的化学发光酶免疫分析方法，是进行化学发光试剂盒的研制的基础，同时对于严把食品安全的检验环节有重要的意义.

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

2000SBL型电子天平，美国Setra公司;90-2型磁力搅拌器，上海振荣科学仪器有限公司;微量移液器，单道20 ～200 μL、100 ～1 000 μL，多道 50 ～300 μL，美国Thermo公司;DSY-Ⅲ型氮吹仪，北京金科精华苑科技有限公司;QL-901型漩涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司;Anke TDL-40B型低速离心机，上海安亭科学仪器有限公司;CentroLB960型微孔板式发光仪，德国Berthold公司;Opti-plateTM型化学发光板，Perkin Elmer公司;DHP-600型生化培养箱，天津市中环实验电炉有限公司.

1.2 材料与试剂

鲁米诺、三(羟甲基)氨基甲烷，Sigma公司;磺胺类药物标准品，德国Dr.Ehrenstorfe公司;牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA，Sigma公司;乙酸乙酯、三乙胺、柱层析、6-氨基烟酸、柱层析、6-氨基烟酸乙酯、4-乙酰氨基苯磺酰氯、二氯乙烷、二甲基甲酰胺，国药集团化学试剂有限公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，美国Jackson公司;弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，北京望尔生物技术有限公司;其他有关化学试剂均为分析纯.

1.3 其他试剂制备

1.3.1 标准品溶液

以常规方法将磺胺类药物纯品用含有10%甲醇的0.05 mmol/L，pH=7.4的PBS配制成浓度分别为 0.0，1.0，3.0，9.0，27.0，81.0 ng/mL 的磺胺类标准溶液，所属百分比为体积百分比.

1.3.2 酶标二抗

用洗涤溶液按照1∶2 000的体积比将辣根过氧化酶标记羊抗鼠IgG配制成酶标二抗工作液.

1.3.3 抗体工作液

磺胺类单克隆抗体是用人工免疫抗原免疫动物制得的单克隆抗体，将所得磺胺类单克隆抗体用洗涤溶液稀释成1∶64 000的工作浓度.

1.3.4 鲁米诺化学发光溶液

A液为鲁米诺含量为0.01 M、对甲苯酚含量为0.001 M pH=8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液;B液为100 mL溶液含柠檬酸2.1 g，无水 Na2HPO42.82 g，0.75%的过氧化氢脲0.64 mL的溶液.

1.3.5 浓缩复溶液

NaH2PO4·2H2O 5.74 g、Na2HPO4·12H2O 32.6 g溶于1 L去离子水中.

1.3.6 浓缩洗涤液

按体积分数0.05%将吐温－20添加至pH=7.4，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中.

2 试剂盒组成及其制备

2.1 试剂盒组成

磺胺类化学发光试剂盒包括:96孔化学发光板1块(包被有偶联抗原);标准液6瓶(1 mL/瓶):0.0，1.0，3.0，9.0，27.0，81.0 ng/mL;高浓度标准品(1 mL/瓶):1 μg/mL;酶标二抗1 mL;抗体工作液7 mL;鲁米诺化学发光液A液6 mL、B液6 mL;20倍浓缩洗涤液40 mL;2倍浓缩复溶液50 mL.

2.2 抗原的合成

2.2.1 母核半抗原合成

于25 mL单口瓶中加入6-氨基烟酸0.87 g，乙醇20 mL，盐酸(12 mol/L)3.7 mL，加热回流，反应8 h，薄层色谱法(thin-layer chromatography，TLC)监测，反应完毕，减压除去溶剂，溶于饱和NaHCO3水溶液，乙酸乙酯萃取，无水Na2SO4干燥，柱层析(乙酸乙酯/石油醚，2/1，v/v)纯化.于25 mL单口瓶中加入6-氨基烟酸乙酯0.89 g，三乙胺(Et3N)1.6 mL，CH2Cl210 mL，搅拌溶解后，加入催化量4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine，DMAP).缓慢滴入含1.57 g 4-乙酰氨基苯磺酰氯的2 mL二氯甲烷溶液，TLC监测，5 h，反应完毕，10 mL水洗3次，饱和食盐水洗一次，干燥，柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，1/10，v/v).于25 mL单口瓶中加入上述产物1 g，2 mol/L NaOH水溶液120 mL，加热回流，TLC监测，反应10 h，反应完毕，调节pH值4～5，有固体析出，得到磺胺母核半抗原.

2.2.2 免疫原(SAs-BSA)合成

取12 mg磺胺类半抗原，溶解于1 mL二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)中，冷却至10℃，取15 mg二氯乙烷(dichloroethane，EDC)用0.2 mL水充分溶解后加入冷却好的磺胺类半抗原DMF溶液中，室温下搅拌24 h，即可得到反应液A.称取BSA 40 mg，使之充分溶解在3 mL PBS(pH 7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24 h，用0.01 mol/L PBS在4℃透析3 d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质.分装，于－20 ℃保存备用［20］.

2.2.3 包被原(SAs-OVA)的合成

称取30 mg OVA和12 mg磺胺母核半抗原，按2.2.2步骤反应，合成SAs-OVA，供包被用.

2.3 单克隆抗体的制备

用上述制备出的免疫原(SAs-BSA)按100 μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7，14，28 d以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3 d以免疫复合物100 μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次.按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45 s内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5%CO2培养箱中培养，5 d后用HT培养基半换液，9 d时候进行全换液，得到杂交瘤细胞，将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存;并取8～10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5 mL/只，7～10 d后腹腔注射杂交瘤细胞1～2×106/只，7～10 d后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用［21－22］.

2.4 磺胺类化学发光检测方法的建立

2.4.1 酶标板的制备

用包被缓冲液将磺胺类包被原稀释成10 μg/mL，每孔加入100 μL，37 ℃温育2 h，倾去包被液，然后在每孔中加入150 μL封闭液，37℃温育2 h，倾去孔内液体，用稀释20倍的浓缩洗涤液洗涤1次，拍干.

2.4.2 确定抗原抗体最佳稀释比例

采用方阵滴定法确定包被原与单克隆抗体的最佳工作浓度.将包被抗原按 160.0，80.0，40.0，20.0，10.0，5.0，2.5，1.25 μg/mL 的系列稀释度包被酶标板，将酶标磺胺类单克隆抗体按1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1∶64 000，1∶128 000，1∶256 000 的倍数进行稀释，用常规ELISA方法，采用方阵法确定抗原抗体的最佳稀释比例［23］.

2.4.3 磺胺类化学发光酶联免疫方法标准抑制曲线的绘制

向用磺胺类偶联包被原包被的酶标板微孔中加入浓度分别为 0.0，1.0，3.0，9.0，27.0，81.0 ng/mL的磺胺类标准品溶液各50 μL，每孔加入酶标羊抗鼠抗体50 μL，再加入磺胺类单克隆抗体工作液50 μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板，25℃恒温箱中反应15 min，倒出孔中液体，重复洗板5次，拍干.每孔加入化学发光显色液100 μL，轻轻振荡混匀，3 min后用微孔板式发光仪测定每个孔的发光强度.每个浓度的标准品溶液的发光强度平均值(RLU)除以第一个标准品溶液(0标准)的发光强度值(RLU0)再乘以100%，得到百分发光强度值，以磺胺类标准品浓度(ng/mL)的对数值(lgC)为x轴，百分发光强度值为y轴，绘制标准曲线图.

2.4.4 检测与其他药物的交叉反应率

以磺胺甲氧异恶唑作为标准，按试剂盒程序操作，加入不同的磺胺类竞争物和非磺胺类竞争物，并以实验所得化学发光强度值，计算抑制百分比并制作标准曲线，根据线性方程计算各竞争物50%抑制浓度(IC50).交叉反应率(CR%)即为抗体对磺胺甲氧异恶唑的IC50与抗体对竞争物的IC50之比的百分数，按式(1)进行计算:

2.4.5 猪肉中磺胺类残留检测

称取2.0±0.05 g均质物至50 mL聚苯乙烯离心管中，加入200 μL 0.1 mol/L NaOH，再加入3.8 mL乙腈和2 mL乙酸乙酯，立即振摇3 min，4 000 r/min离心5 min;取3 mL上清液至10 mL干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干;加入1 mL正己烷，用涡旋仪涡动30 s溶解干燥残留物，加入1 mL磷酸盐缓冲液，用涡旋仪涡动10 s后转入2 mL离心管中，4 000 r/min，室温(20～25℃)离心5 min;除去上层正己烷相，取下层水相50 μL用于分析.

2.4.6 最低检测限

取20份不含磺胺类药物的空白猪肉样品，按照2.4.5步骤处理后所建立的ELISA方法进行检测.通过标准曲线计算对应的浓度.以20份空白样品对应的样品浓度平均值加上3倍标准差作为样本检测的最低检测限:

式(2)中:x为20份空白样品的平均值，s为20份空白样品的标准差.

2.4.7 准确度及精密度

取磺胺甲氧异恶唑标准品分别对猪肉样品按照1.0 ng/g、2.0 ng/g进行添加回收实验.分别抽取3个批次试剂盒进行检测，每个浓度做6个重复，每个样品2个平行，计算准确度及精密度.

2.4.8 试剂盒稳定性实验

取磺胺类药物化学发光试剂盒用于稳定性实验的测定，分别放置－20℃冰箱和37℃温箱6 d后进行实验，比较放置前后各标准品发光强度值变化.

3 结果

3.1 磺胺半抗原的结构特点及其TLC色谱

合成后的半抗原结构图如图1.

图1 磺胺类半抗原结构Fig.1 SAs hapten chemical structure

从合成的半抗原TLC可以看出，在450 nm紫外灯下磺胺类药物半抗原在薄层板上已经呈现出规则的原点状，并且无拖尾现象，证明合成的磺胺类半抗原的纯度较高，如图2.

半抗原分子中，左半边结构保持了磺胺类化合物的共有特征结构，而因为磺胺类化合物右半边大部分结构都是含N的杂环结构，所以在半抗原右半边引入带羧基的吡啶环结构，从而更易产生对大部分磺胺类化合物具有交叉反应的抗体.

图2 磺胺类半抗原薄层色谱图Fig.2 SAs hapten thin-layer chromatograms

3.2 包被抗原及SAs单抗最佳稀释倍数

经方阵法实验，根据实验得到的0 μg/L标准品吸光度值(OD值)和1.0 μg/L标准品OD值，计算抑制率，结果如表1.

对于酶标仪，OD值在1～2时读数的可信度较大，所以一般取OD值在1.5～2.0的孔所对应的包被浓度为最佳包被浓度;另外为了试剂盒的灵敏度和准确度考虑，一般控制抑制率在70% ～80%，从表1中可知，抗体、抗原包被浓度过大，OD值普遍偏高，另外抗体浓度大或包被浓度大，也是造成不必要的浪费.抗体浓度小或者抗原包被浓度太小，则造成整个板显色偏低，当抗原包被浓度为10 μg/mL，SAs单抗稀释倍数为1∶64 000时，实验效果较理想(OD值在1.5～2.0，抑制率在70% ～80%)，因此，确定抗原包被浓度为10 μg/mL，SAs单抗的稀释倍数为1∶64 000.

3.3 竞争反应时间优化

按上述实验方法加入标准品和标记抗体后测定室温下反应10，15，20，25 min后加入发光溶液，测定0标准品的发光值，结果表明在反应15 min时，发光值最大，因此本试剂盒选取反应时间为15 min.结果见图3.

根据确定好的反应模式和反应时间，与常规EILSA方法进行反应时间比较，结果见表2.

从表2可以看出，化学发光试剂盒方法比常规ELISA方法节省时间至少47 min，最多可节省72 min.

3.4 标准工作曲线

以磺胺甲氧异恶唑标准品浓度对数为横坐标，发光百分比(RLU/RLU0)为纵坐标，绘制抑制标准曲线，结果见图4。

表1 抗原抗体最佳稀释浓度实验结果Tab.1 Antigen and monoclonal antibody diluted concentration testing

表2 化学发光试剂盒与ELISA试剂盒反应时间比较Tab.2 Reaction time comparison of CLEIA kit and ELISA kit min

从图4中可以看出，得到的曲线线性方程为y=－35.166x+69.165，线性相关系数 R2=0.991 9，其中y为RLU值，x为磺胺甲氧异恶唑标准品浓度对数.

将磺胺甲氧异恶唑浓度对数值用专业分析软件替换为磺胺甲氧异恶唑浓度，制作标准工作曲线，用以分析样品中磺胺类药物残留，所得标准工作曲线见图5.

由图5得出IC50值为3.047 ng/mL，线性范围为1.0～81.0 ng/mL.

图3 反应时间与发光强度的关系Fig.3 Relationship of reaction time and luminescent intensity

图4 磺胺类试剂盒线性回归方程及标准曲线Fig.4 Equation of linear regression and standard curve of the SAs kit

图5 磺胺类试剂盒标准工作曲线Fig.5 Standard working curve of SAs kit

3.5 试剂盒特异性

磺胺类单克隆抗体对其类似物的交叉反应率见表3.

表3可见，该单克隆抗体对17种磺胺类药物的交叉反应率均较高，而对非磺胺类药物基本无交叉反应，所以该试剂盒适用于检测17种磺胺类药物的总残留量.

3.6 最低检测限

对20份不含磺胺类药物的空白猪肉样本进行检测，测定结果的平均值加上3倍标准差为该方法对实际样本的最低检测限，结果见表4.根据20份样本的检测结果，并利用公式计算，该试剂盒对猪肉样本的最低检测限为0.74 ng/g.

表3 磺胺类试剂盒特异性实验Tab.3 Specific testing of SAs kit

3.7 准确度与精密度

ELSIA法的准确度以回收率表示，精密度以变异系数来表示.取猪肉样本分别添加磺胺甲氧异恶唑标准品至1.0 ng/g和2.0 ng/g，对样本进行添加回收实验，分别计算准确度和精密度，检测结果见表5.

从表5可知，试剂盒对猪肉样本的添加回收率在70% ～100%，批内变异系数在10.4% ～14.1%，批间变异系数在11.7%～12.2%.

表4 该方法对猪肉的最低检测限Tab.4 Lowest detection limit of method for pork ng/g

表5 准确度和精密度实验结果Tab.5 Results of accuracy and precision testing

3.8 试剂盒稳定性

试剂盒分别放置于－20℃冰箱和37℃温箱6 d后进行实验，比较放置前与放置后参考标准品各点RLU值，参考标准品各点RLU值未见明显降低，且本底发光值无明显升高，表明试剂盒标准曲线无明显漂移，满足稳定性要求.在实际应用中，试剂盒一般存放在2～8℃冰箱，所以对于整体试剂盒的稳定性评判，还需要进行2～8℃放置保存实验，从而进一步验证试剂盒的稳定性.

4 结论

由于磺胺类药物是小分子物质，没有免疫原性，所以必须连接到大分子载体上产生特异性免疫应答，本实验将磺胺类药物的母核分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白偶联，合成免疫原和包被原.本研究根据间接竞争反应原理建立快速检测SAs的一步式CLEIA，经进一步优化，其最佳反应条件为:抗原包被浓度为10 μg/mL，包被温度为37℃，反应2 h，SAs单抗最佳稀释倍数为1∶64 000，竞争反应15 min，洗涤液为pH 7.4、含0.05%吐温 －20的 PBST溶液.本研究所制备的单克隆抗体对磺胺类药物具有很高的特异性(IC50=3.047 ng/mL)，并且对磺胺类药物抑制标准曲线线性良好，对17种磺胺类药物类似物的交叉反应率较高，而对其他非磺胺类药物无交叉反应，该试剂盒的标准曲线线性范围为1.0～81.0 ng/mL，IC50为 3.047 ng/mL，对猪肉的最低检测限为0.74 ng/g，样本添加回收率在70.0% ～100.0%，批内变异系数在10.4% ～14.1%，批间变异系数在11.7%～12.2%.

我国规定，磺胺类药物在食品中的残留限量为所有食品动物肌肉、动物肝、牛奶 100 mg/kg［24］，本实验方法的各项指标均能满足检测要求.经检验，与常规一步式或两步式ELISA的检测效果基本一致，且可缩短反应时间约60 min.可见，以一步式CLEIA检测动物组织中得SAs残留更符合快速检测的要求，实现了对SAs残留的简便、快速、精确检测.

［1］郝晓丽.磺胺类药物残留检测方法研究［D］.北京:首都师范大学，2009.

［2］姜大富.磺胺类药物的临床应用及使用心得［J］.畜牧兽医科技信息，2006(6):85.

［3］胡园园，陈一资.胺类药物磺胺二甲嘧啶对人和动物的危害机理及其残留的检测方法［C］.中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会第五次会员代表大会暨第九次学术交流会.北京:2006.

［4］陈瑞玲.磺胺类药与甲氧苄啶的合理应用［J］.中国临床医生，2008，36(7):18-20.

［5］王瑞深.肉品中残留磺胺类药的危害及其监控［J］.兽医导刊，2010(2):50-51.

［6］刘正才，杨方，余孔捷，等.超高效液相色谱-串联质谱法快速检测鳗鱼中磺胺类、喹诺酮类、四环素族抗生素药物残留［J］.食品科学，2009，30(14):167-170.

［7］张海玲.分泌抗磺胺类药物单克隆抗体杂交瘤株的建立［D］.哈尔滨:哈尔滨工业大学，2009.

［8］赵书景，贺绍君，罗国琦，等.动物性食品中磺胺类药物残留检测方法的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2009(8):60-63.

［9］陈莹，陈辉，林谷园，等.喹诺酮类和磺胺类兽药残留量的同时测定［J］.分析测试学报，2008，27(5):538-541.

［10］庞国芳，曹彦忠，张进杰，等.液相色谱-串联质谱同时测定家禽组织中16种磺胺残留［J］.分析化学，2005，33(9):1252-1256.

［11］杨瑞芬，施治国，冯钰錡，等.磺胺类药物的毛细管高效液相色谱与电色谱研究［J］.药学学报，2003，38(2):129-132.

［12］刘宣兵，张改平，刘庆堂.磺胺甲嗯唑单克隆抗体的研制及免疫金标试纸检测方法的建立［J］.农业生物技术学报，2009(1):18-23.

［13］谢玉璇，谢天饶，刘秋英，等.毛细管电泳-电导法分离检测磺胺嘧啶，磺胺甲嘧啶和磺胺二甲嘧啶［J］.分析测试学报，2006，25(3):100-102.

［14］孙俊颖，于洪意，黄显会，等.磺胺类药物多克隆抗体的制备与ELISA检测方法的初步研究［J］.畜牧兽医学报，2008(11):1594-1598.

［15］沈建忠，何方洋，何继红，等.动物组织中磺胺二甲嘧啶残留检测 ELISA试剂盒的研制［J］.中国兽医杂志，2003，39(6):6-8.

［16］关嵘，顾鸣，魏万贵，等.酶联免疫法检测动物组织中磺胺嘧啶残留方法的建立［J］.检验检疫科学，2004，14(1):3.

［17］刘百红，熊宁，王喜亮，等.直接竞争ELISA法快速检测动物源性食品中磺胺嘧啶残留［J］.中国兽药杂志，2008，42:16-19.

［18］詹先发，张黎，胡国茂，等.梅毒螺旋体抗体化学发光试剂盒的研制及相关方法的比较［J］.中国医学检验杂志，2008(1):8-9.

［19］李超，刘树元，李媛媛，等.化学发光分析法的发展与应用［J］.分析测试技术与仪器，2006，12(2):75-81.

［20］Wang Yu，Xu Zhen-lin，Xie Yan-yun，et al.Development of polyclonal antibody-based indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for sodium saccharin residue in food samples［J］.Food Chemistry，2011，126(2):815-820.

［21］王颖，任立松，李研东，等.抗氯霉素单克隆抗体的制备、纯化及其特异性鉴定［J］.吉林大学学报:医学版，2008，34(2):336-339.

［22］孙海新，凌红丽，张玉兰，等.沙丁胺醇人工抗原的合成及抗体制备［J］.中国生物工程杂志，2009，30(2):48-53.

［23］钟寒燕.抗氯霉素单克隆抗体的制备及化学发光酶免疫分析方法的建立［D］.江西:南昌大学，2010.

［24］周宏敏，欧惠超，姜浩，等.利用表面等离子共振技术快速检测牛奶中的磺胺甲噁唑［J］.食品科学，2010，31(6):168-171.

(责任编辑:李 宁)

Preliminary Study on Chemiluminescent Enzyme Immunoassay Kit for Sulfonamides in Food

WAN Yu-ping， WU Peng， FENG Yue-jun， LUO Xiao-qin， HAN Jing-peng
(Beijing Kwinbon Biotechnology Co.Ltd.，Beijing 102206，China)

Based on conventional enzyme linked immunoassay(ELISA)，a convenient，rapid and accurate one-step sulfonamides(SAs)residue chemiluminescent enzyme immunoassay(CLEIA)detection method was established through obtaining monoclonal antibodies from immunizing mice which was injected with SAs-BSA coupling protein，and optimizing test parameters such as antibody concentration，reaction time.The results showed that the best detection range of this method was 1.0～81.0 ng/mL，the IC50was 3.047 ng/mL，the detection limit was 0.74 ng/mL.Compared with conventional ELISA，the CLEIA method can not only increase the detection limit and sensitivity，but also shorten the reaction time by 60 minutes.CLEIA kit is more appropriate for rapid detection of the SAs residue in food.

veterinary medicine;detection techniques;sulfonamides;chemiluminescent enzyme immunoassay;kit

TS201.6

A

1671-1513(2012)02-0027-08

2011-10-24

万宇平，男，北京勤邦生物技术有限公司副总经理兼研发总监，主要从事食品安全快速检测技术方面的研究.