杨文超 刘 赛 吴珍红 缪晓青

（福建农林大学蜂学学院, 蜂产品加工与应用教育部工程研究中心，福州 350002）

蜂粮也称蜂巢花粉、蜂面包，是雄蜂和工蜂的主要食料和营养来源，蜂粮是一个复杂的微生物系统，具有宝贵的微生物资源[1，2]。优良菌株是发酵制品得到良好的风味、质地以及产品稳定性的基础，是保证产品标准化的关键[3]。乳酸菌不仅可以改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，还有很多特殊的医疗保健功能[4-7]。从蜂粮中筛选出具有优良发酵性能的乳酸菌菌株应用在蜂花粉的发酵中，对油菜蜂花粉的深加工开发具有指导意义。

1 材料和方法

1.1 材料和设备

MRS液体培养基（1000ml）：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4·7H2O 2.0g，醋酸钠·3H2O 5.0g，柠檬酸三铵 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，吐温801.0ml，pH6.2，115 ℃灭菌15～20 min；MRS培养基：MRS液体培养基中加入1.5%琼脂粉；麦芽汁琼脂培养基：5°Bé麦芽汁100ml，琼脂1.5g，pH=7.0；红曲霉种子培养基（100ml）：5g玉米粉加适量水，于60℃水浴4 h后用8 层纱布过滤，去除残渣得到玉米浆，加入0.2gNaNO3，0.5g KH2PO4，0.1g MgSO4·7H2O，补足蒸馏水；pH自然，121℃灭菌30min；红曲霉发酵培养基：玉米粉10%，NaNO30.5%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH自然；配置方法详见红曲霉种子液。

蜂粮源乳酸菌的选定：经过分离、纯化、初筛、复筛，从蜂粮样品中得到3株乳酸菌。根据API 50 CH鉴定系统鉴定结果，3株菌分别为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌干酪亚种（Lactobacillus casei ssp casei）、德式乳杆菌德氏亚种（Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii）。分别接种到油菜蜂花粉中进行单菌发酵，测定菌体生长情况和产酸情况，确定植物乳杆菌最适宜应用于蜂花粉发酵。

油菜蜂花粉：由福建省神蜂科技开发有限公司提供；烟色红曲霉：购于中国工业微生物菌种保藏中心；胃蛋白酶：天津市诺奥科技发展有限公司。

电热恒温生化培养箱 SPX-250B-Z（上海博迅实业有限公司），电热恒温水浴锅 DK-98-1（天津泰斯特仪器制造有限公司），人工净化操作台 SWCJ -1D（苏州净化设备有限公司），立式压力蒸汽灭菌器 YXQ-LS-75SП（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），恒温摇床 HZ250L（武汉瑞华仪器设备有限责任公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种培养

乳酸菌：从MRS斜面上挑取2～3环菌株，接入装有10ml MRS液体培养基的试管中，36℃静止培养12h，再以10%接入量接入装有100ml MRS液体培养基的250ml三角瓶中，36℃增菌培养12h。

红曲霉：用无菌水洗下麦芽汁斜面培养基菌种，并刮下表面菌丝，接种到装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃、200r/min摇床培养2d。

1.2.2 红曲霉发酵液制备

将培养好的种子液以10%接种量接入到装有100ml发酵液培养基的500ml三角瓶中，30℃、200r/min摇床培养7d。

1.2.3 接种方式确定

（1）植物乳杆菌单菌发酵；（2）将乳酸菌与红曲霉种子液同时接入到蜂花粉中发酵；（3）先将红曲霉种子液接种到红曲霉发酵液中摇瓶培养，将乳酸菌种子液接入到蜂花粉中，同时添加制备好的红曲霉发酵液。以乳酸菌活菌数和蜂花粉pH值为参考指标，比较发酵效果。

1.2.4 蜂花粉发酵工艺条件的优化

根据单因素试验结果确定乳酸菌接种量（%）、红曲霉发酵液添加量（%）、加水量（%）、发酵温度（℃）设计L9（34）正交试验，以乳酸菌活菌数和感官评分为指标对发酵工艺进行优化。

1.2.5 蜂花粉乳酸菌计数

称取5.0g发酵后的蜂花粉，十倍稀释法制得适宜稀释度的样品稀释液。选择2～3个适宜稀释度，分别吸取1 ml，倾注法接种到MRS培养基，36 ℃厌氧培养48h（每个稀释度做两个平板）。选取菌落总数在30CFU-300CFU之间的平板计数，取平均值[8]。

1.2.6 感官评定

参考“0-4评判法”[9]，请10名从事食品研究的工作者对各因素两两进行重要性比较，确定发酵蜂花粉感官评价时各因素的权重：A=[0.34，0.27，0.39]

以发酵蜂花粉的颜色、香气和滋味三个因素为主要评价指标，每个指标满分为5分。请10名食品感官质量考评员进行感官质量评价，评分标准见表1。

1.2.7 验证试验

表1 发酵蜂花粉感官评分标准

用正交试验确定的最佳条件进行蜂花粉发酵，测定所的结果，比较其与试验组的差异。

2 结果与分析

2.1 接种方式的确定

从表2中可知，同时发酵时，乳酸菌活菌数随着发酵时间的延长而下降，分析原因可能是红曲霉生长周期较长，其生长消耗蜂花粉中营养物质，乳酸菌不能进一步获取足够的营养物质而死亡；也有关于红曲霉与乳酸菌之间存在相互抑制作用的报道[10]。同时，从表2中可以看出，添加红曲霉发酵液对乳酸菌的生长有一定的促进作用，原因可能是红曲霉发酵液的中含有蛋白酶、糖化酶等，能够分解蜂花粉中的大分子营养物质，从而为乳酸菌生长代谢提供能量来源。综合比较可知，最佳接种方式为先将红曲霉种子液接种到红曲霉发酵培养基进行摇瓶培养，将制备好的红曲霉发酵液添加到蜂花粉中，接种乳酸菌种子液进行发酵。

2.2 乳酸菌接种量对发酵结果的影响

表2 不同接种方式的乳酸菌活菌数和蜂花粉pH值

表3 乳酸菌接种量对产品的活菌数和感官特征的影响

当乳酸菌接种量小于10%时，乳酸菌体数量较少，蜂花粉发酵不明显，香气和滋味都不理想，乳酸菌活菌数也较少；接种量达到10%时，蜂花粉发酵较充分，乳酸菌活菌数也较高，从节约成本的角度出发，确定乳酸菌接种量的最佳值为10%。

2.3 红曲霉发酵液添加量对发酵结果的影响

添加量为5%时，蜂花粉中乳酸菌活菌数低，感官也较差，这可能是因为酶类物质不足，乳酸菌发酵受到限制。当添加量大于15%时，乳酸菌活菌数较高，但产品感官较差，原因可能有：1）红曲霉发酵液颜色较深，添加量过多会影响产品色泽；3）红曲霉发酵产生酱香气；2）乳酸菌在酶类物质的帮助下，在蜂花粉中的存活时间延长，从而产酸多，使产品过酸。综合以上原因，选择10%为红曲霉发酵液最佳添加量。

2.4 加水量对发酵结果的影响

由表5可知，随着加水量的增加，蜂花粉中乳酸菌活菌数增加，但加水量大于20%后，蜂花粉香气较弱。当加水量为20%时，乳酸菌活菌数高，感官特性也好，故选择最佳加水量为20%。

表4 红曲霉发酵液对产品的活菌数和感官特征的影响

表5 加水量对产品的活菌数和感官特征的影响

2.5 发酵温度对发酵结果的影响

在一定范围内，随着温度的升高，乳酸菌活菌数增加，36℃时达到最高峰。从感官角度考虑，温度过低时发酵不充分，蜂花粉还带有苦味，而过高时产品颜色较深，滋味也不佳。当发酵温度为33℃时乳酸菌活菌数较高，感官特性好，因此选其为发酵最佳温度。

2.6 发酵工艺条件正交试验

正交试验结果见表7。

从表中的极差分析可以看出，对乳酸菌活菌数的影响由大到小的顺序为乳酸菌活菌数＞红曲霉发酵液添加量＞加水量＞发酵温度最优水平为A3B3C3D2。而影响产品感官分数的因素主次顺序为乳酸菌活菌数＞红曲霉发酵液接种量＞发酵温度＞加水量，因素最优水平为A3B2C1D2。可见对于乳酸菌活菌数和感官分数而言，4个因素的影响程度不一致，最优方案也不同。为了进一步比较各因素水平的优先顺序，分别以活菌数、感官分数极差值的平均值Ki为纵坐标，以各因素水平为横坐标做图（图1和图2）。

表6 发酵温度对产品的活菌数和感官特征的影响

表7 L9(3)4正交试验结果

图1 乳酸菌活菌数随各因素水平的变化趋势

图2 感官分数随各因素水平的变化趋势

结合图5和6和极差分析，因素A对于两个指标都是取A3好；因素B是两个指标中较重要的因素，对于乳酸菌活菌数而言，取B3（13%）最好，但取B3时感官分数低。因此感官特征优先考虑选择B2。因素C从乳酸菌活菌数角度出发，应取C3（15%），但对感官分数而言取C1好。由于因素C3对乳酸菌活菌数的影响大于对感官的影响，因此选择C3。因素D对于两个指标都是取D2好。综合各个因素，发酵工艺的最佳组合为A3B2C3D2，即乳酸菌接种量13%，红曲霉添加量10%，加水量25%，发酵温度33℃。

2.7 验证试验

乳酸菌接种量13%，红曲霉添加量10%，加水量25%，发酵温度33℃ 进行油菜蜂花粉的发酵，产品的乳酸菌活菌数为2.2×107cfu/g，感官评分4.24，优于其他实验组。

3 结论

采用从蜂粮中分离得到的植物乳杆菌可以对蜂花粉进行发酵。通过以乳酸菌活菌数和感官评分为试验指标，在单因素基础上对发酵工艺进行优化，正交试验得到发酵工艺的最佳组合为乳酸菌接种量13%，红曲霉发酵液添加量10%，加水量25%，发酵温度33℃。发酵后的蜂花粉酸甜适口，且富含益生菌。

[1]黄文诚.微生物对蜂群营养和健康的重要性[J].中国蜂业,2010,61,(04):54-55.

[2]Ján Brindza1, Kamila Bacigálová, Peter Ferianc.Pollen microbial colonization and food safety.Acta Chimica Slovaca,2010,3(1):95-102.

[3]孙桂丹.四川泡菜中优良乳酸菌菌种的筛选及发酵条件初探[D].四川: 四川农业大学, 2007, 06:6-7.

[4]Z.Abouda,I.Zerdani,I.Kalalou.The antibacterial activity of Moroccan bee bread and bee-pollen(fresh and dried) against pathogenic bacteria.Research Journal of Microbiology[J].2011,6(4):376-384.

[5]Phikunthong Kopermsub, Sirinda Yunchalard.Identification of lactic acid bacteria associated with the production of plaa-som, a traditional fermented fish product of Thailand.[J].International Journal of Food Microbiology, 2010,138: 200-204.

[6]Abd El Gawad, Abd El Fatah, Al Rubayyi.Identification and characterization of dominant lactic Acid bacteria isolated from traditional Rayeb milk in Egypt[J].Journal of American Science 2010;6(10): 728-735

[7]朱军,莉王晔,励建荣.生物保鲜乳酸菌的筛选及其细菌特性的研究[J].中国酿造,2010(5):42-46.

[8]GB 4789.35—2010,食品微生物学检验 乳酸菌检验[S].

[9]徐树来,王永华.食品感官分析与实验[M]（第二版）.北京:化学工业出版社,2010.

[10]徐冬云.红曲霉产降血压活性物质的研究[D].浙江工业大学,2006,04:74-78.