金 辉 杨 煜 吕若谷 谢 宇 吕文伟 (吉林省人口生命科学技术研究院，吉林 长春 006)

龙眼参Longyanshen，LYS原植物为蝶形花科植物蔬叶崖豆Millettia pulchra Kura Var.laxior(Dunn)Z.Wei的块跟〔1〕，是广西民间广泛应用的壮药。前期实验证明，龙眼参黄酮对犬急性心肌缺血时心外膜电图及心肌酶具有一定的影响〔2〕，能够改善急性心肌缺血所致的心肌光镜及电镜下细胞的损失程度〔3〕;同时，龙眼参黄酮具有减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用〔4〕，清除机体氧自由基〔5〕。本实验研究龙眼参黄酮对局灶性脑缺血大鼠的保护作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 步长脑心通胶囊由陕西咸阳步长制药有限公司提供，批号：060823。氯化三苯基四氮唑(TTC)由上海化学试剂公司提供，批号：20091009。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.2 动物 健康雄性Wistar大鼠，体重250～350 g，由吉林大学白求恩医学院动物实验研究中心提供，动物合格证号：SCXK-(吉)2003-0001。

1.1.3 仪器 722型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司生产;CS501恒温浴槽，南通科学仪器厂生产;LDZ5-2型离心机，北京医用离心机厂生产;DT-500型电子天平，常熟双杰测试仪器厂生产;LEICA QWIN图像分析仪。

1.2 方法

1.2.1 大鼠局灶性脑缺血模型(MCAO)制备 取48只雄性大鼠，随即分为假手术组、模型组、阳性药组(步长脑心通2.0 g/kg)及龙眼参黄酮高、中、低剂量组(2.0、4.0和8.0 g/kg)。每天灌胃给药一次(假手术组和模型组给予等容积生理盐水)，连续给药7 d。末次给药1 h后，模型组、阳性药组及龙眼参黄酮各剂量组大鼠称重后腹腔注射水合氯醛(0.3 g/kg)麻醉，仰卧位固定于鼠板上。剪开颈部正中皮肤，钝性分离并暴露左侧颈总及颈内、外动脉，并在颈内外动脉分叉处结扎颈外动脉，左侧颈总动脉分叉处剪口，插入头端烧成圆钝形直径为0.25 mm的尼龙线，进线长度约18～20 mm，在大脑中动脉起始端堵塞大脑中动脉，然后将颈总动脉连同尼龙线一起结扎，逐层缝合后放回笼内。术后37℃保温，待动物清醒后通过Zea Longa神经功能学评分判定是否造模成功。假手术组只分离、暴露血管，不结扎颈总动脉及颈外动脉，不插入尼龙线。

1.2.2 大鼠神经功能学评分的测定 按文献〔6〕所述，待大鼠清醒后进行神经功能学评分：0分，无神经功能缺失症状;1分，梗死对侧前爪内收、不能伸直;2分，前肢屈曲，对侧抵抗推力下降，向对侧转圈;3分，行走时身体向偏瘫侧倾倒;4分，意识丧失，完全不能行走。

1.2.3 脑组织含水量测定 取48只雄性大鼠，分组、给药及造模同前。大鼠麻醉后断头取脑，去除小脑、脑干及嗅球，电子分析天平称取脑湿重，置于110℃烤箱中烘烤至恒重时称取脑干重，按公式：脑组织含水量=(湿重－干重)/湿重，计算出脑组织的含水量。

1.2.4 脑梗死面积的测定 如前所述，大鼠麻醉后断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，从额板开始间隔2 mm冠状切片，将切片置于1%TTC溶液中(37℃)避光孵育30 min，然后置于10%甲醛中固定，正常组织染成红色，梗死区呈现白色。数码相机摄像，利用LEICA QWIN图像分析仪测定脑梗死面积，计算脑梗死面积占全脑面积的百分比。

1.2.5 大鼠血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的测定各组大鼠腹主动脉取血，3 000 r/min，离心10 min，吸取血清。按试剂盒说明测定血清GSH-Px、CAT、SOD和MDA的含量。

1.2.6 大鼠脑组织病理形态学观察 脑组织经10%甲醛固定48 h后，脱水、固定、石蜡包埋、常规切片、HE染色，光镜下观察组织形态。

1.3 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行分析，剂量资料以s表示。

2 结果

2.1 龙眼参黄酮对局灶性脑缺血大鼠神经行为学评分、脑组织含水量、脑梗死面积以及血清中SOD、CAT、GSH-Px及MDA含量的影响 预防性给予龙眼参黄酮4.0和8.0 g/kg组在术后能减少局灶性脑缺血所致的大鼠神经功能学变化(P＜0.05)。阳性药组、龙眼参黄酮中剂量组大鼠脑组织的含水量明显低于模型组(P＜0.05)，龙眼参黄酮大剂量组的作用更加明显(P＜0.01)。龙眼参黄酮中、高剂量组大鼠的脑梗死面积明显低于模型组(P＜0.05，P＜0.01)。龙眼参黄酮中、高剂量组大鼠血清SOD、CAT、GSH-PX含量高于模型组(P＜0.01，P＜0.001)，而血清MDA水平低于模型组。见表1。

表2 龙眼参黄酮对局灶性脑缺血大鼠神经功能学、脑含水量评分以及血清SOD、CAT、GSH-Px及MDA含量的影响( s ，n=8)

表2 龙眼参黄酮对局灶性脑缺血大鼠神经功能学、脑含水量评分以及血清SOD、CAT、GSH-Px及MDA含量的影响( s ，n=8)

与脑缺血模型组比较：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01，3)P ＜0.001

组别 剂量(mg/kg)评分 脑含水量(%)脑梗死面积(%)SOD(U/ml)CAT(ml/L)GSH-Px(ml/L)MDA(nmol/ml)88±90.16 4.66±1.94模型组 － 3.25±0.71 78.88±7.61 28.38±4.57 151.38±10.77 9.06±2.23 266.13±48.54 6.63±1.73阳性药组 2.0 2.38±0.531) 70.00±4.841) 23.25±3.011) 162.13±13.641) 11.14±2.071) 344.50±70.081) 5.43±1.261)龙眼参黄酮组 2.0 2.75±0.71 72.13±8.37 26.38±3.46 160.25±13.10 10.64±2.37 308.63±54.35 5.85±1.18 4.0 2.25±0.462) 69.50±6.281) 22.75±2.821) 166.25±8.502) 12.51±2.732) 349.23±54.391) 4.99±1.381)8.0 1.75±0.712) 67.50±6.952) 21.88±1.822) 168.75±6.922) 13.20±1.362) 398.25±46.313) 4.81±0.941)假手术组 － 0 66.88±7.22 0 175.25±24.50 14.67±1.94 414.

2.2 龙眼参黄酮对局灶性脑缺血大鼠病理形态学的影响 假手术组：镜下神经元细胞与神经胶质细胞分布正常，神经元胞体椭圆，有小突起，胞核呈圆形，核仁清晰，稍见极轻微脑水肿。模型组：镜下脑组织严重水肿，部分神经元变性坏死，表现为细胞胞体固缩，胞核固缩甚至消失，胞质浓染着色较深，神经元呈嗜伊红深染的多角形或小圆形，可见嗜神经现象;缺血区的脑组织结构变得疏松，有筛状软化灶形成。阳性药组：镜下依然可见脑组织水肿，部分神经元呈变性坏死，表现为胞质呈嗜伊红，胞体为三角形，胶质细胞增生，可见嗜神经现象;依然可见脑组织结构疏松，筛状软化灶形成。龙眼参黄酮低剂量组：镜下可见脑组织水肿，神经元变性坏死坏死区内组织结构疏松，可见嗜神经现象;脑组织结构疏松，可见筛状软化灶。龙眼参黄酮中剂量组：镜下可见脑组织水肿，大部分神经元正常，表现为胞体有突起，胞核圆形，核仁清晰;但依然可见灶状神经元变性坏死改变，胞质呈嗜伊红改变，胞体为三角形;脑组织结构疏松淡染。龙眼参黄酮高剂量组：镜下可见脑组织水肿，大多数神经元与胶质细胞分布结构均无明显异常。但依然可见少数神经元呈变性坏死改变，其胞体为三角形，胞质呈嗜伊红增强，这些神经元散在分布，无脑组织结构疏松及筛状软化灶形成。见图1。

图1 龙眼参黄酮对局灶性脑缺血大鼠病理形态学的影响(HE，×100)

3 讨论

脑缺血损伤主要指由于脑动脉管腔狭窄或堵塞，局部脑血流量减少或突然中断，造成脑动脉供应区的脑组织供血、供氧、供能减少，出现去极化和炎症反应;由于脑水肿和脑细胞坏死，继而引起继发性的血管内皮损伤和自主神经功能障碍的一种病理状态〔6〕。本实验结果说明龙眼参黄酮可减轻缺血所造成的脑组织损伤和脑组织水肿，改善脑功能，对脑组织起保护作用。

自由基攻击生物膜磷脂分子中不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化反应，产生脂质过氧化物，再经过过氧化物酶分解生成MDA，最终使磷脂结构发生变化，生物膜受到严重的损害。MDA作为自由基引发的脑脂质过氧化反应的代谢产物，其含量多少直接反映自由基损伤程度。在脑内清除自由基的系统中，SOD发挥着重要的作用。CAT、GSH-Px在细胞代谢过程中可还原或清除H2O2。本实验结果表明，龙眼参黄酮可增强机体对自由基的清除能力，减轻细胞膜脂质过氧化损伤，从而发挥对细胞膜的保护作用。

缺血性脑血管病多为脑血管痉挛或栓塞引起脑组织缺血缺氧而致能量耗竭、兴奋性氨基酸释放、细胞内钙超载、自由基的产生等，导致脑组织水肿、神经细胞变性坏死，脑细胞的各种生物酶活性丧失或转化为对脑细胞有损害的酶，线粒体破坏，功能丧失，溶酶体膜裂解，大量溶媒溢入细胞质，促使脑细胞发生自溶。由此可见，自由基介导的自由基连锁反应是脑缺血后继发性损伤的重要环节之一〔7〕。本实验模型组镜下可见缺血区脑组织神经元呈变性坏死缺血性改变，表明脑缺血模型是成功的。阳性药组和龙眼参黄酮低、中剂量组的神经元变性坏死改变略有减轻，高剂量组神经元变性坏死轻微，未见筛状软化灶，治疗效果明显。

综上所述，龙眼参黄酮对脑缺血具有保护作用，其机制可能是通过抗氧化损伤实现的。

1 广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准〔S〕.南宁：广西科学技术出版社，1990.

2 赵 宏，杨 煜，王景祥，等.龙眼参黄酮对急性心肌缺血时心外膜电图及心肌酶的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2011;17(2)：206-8.

3 薛世泉，杨 煜，吕铭洋，等 龙眼参黄酮对急性心肌梗死犬心肌超微结构的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(2)：276-8.

4 张绪东，蒋伟哲，焦 阳，等.龙眼参黄酮抗心肌缺血再灌注引起的脂质过氧化损伤的研究〔J〕.时珍国医国药，2008;19(3)：607-9.

5 刘志蜂，李 萍，李桂生，等.龙眼参黄酮抗血小板聚集及抗血栓作用的观察〔J〕. 中药药理与临床，2000;16(6)：20-1.

6 王淑民，闫美玲.抗脑缺血药物的作用机制研究进展〔J〕.中国药物应用与监测，2008;5(3)：30-1.

7 Lewen A，Matz P，Chan PH.Free radical pathways in CNS injury〔J〕.Neurotrauma，2000;17(10)：871-90.