向 薇 (湖北民族学院附属民大医院急救中心，湖北 恩施 445000)

血清中肿瘤标志物的检测为恶性肿瘤在危险人群中的筛查提供了一种简便可靠的手段，但是由于其含量往往很低，导致必须用相对灵敏的方法才可以检测到，并且有漏诊的可能。此前，在临床上应用较多的肿瘤标志物主要为糖蛋白抗原(CA125)，CA15-3 和鳞状细胞癌抗原(SCCA)〔1～3〕。由于这 3种靶分子在卵巢癌，子宫内膜癌和宫颈癌患者中有一定的偏嗜性分布，因此即使联合测定也存在着漏诊的可能。本文针对妇科盆腔恶性肿瘤以上皮性肿瘤为主的特点，建立了检测外周血细胞角蛋白20(ck20)mRNA的RT-PCR测定方法，并与其他三种肿瘤标志物联合对临床患者进行了实验性检测。

1 材料与方法

1.1 材料 选择因盆腔肿瘤入院，行肿瘤摘除术的患者。依据术后病理诊断进行分组，其中子宫内膜癌17例，年龄47～61〔平均(52.5±5.2)〕岁;卵巢癌 11例，年龄 44～65〔平均(50.3±5.7)〕岁;宫颈癌 14例，年龄 43～58〔平均(49.7±6.2)〕岁;子宫肌瘤18例，年龄39～55〔平均(47.2±6.8)〕岁。收集手术患者术前及术后第30天外周静脉血，部分以乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝用于外周血单个核细胞(PBMC)RNA的提取;部分不抗凝，用于血清肿瘤标志物的ELISA检测。同时收集术中切除的肿瘤组织，作为ck20基因表达的阳性对照。对照人群：参加体检的健康妇女，无免疫病史及肿瘤家族史，年龄38～59〔平均(51.4±7.8)〕岁。采集外周血，同样分为EDTA抗凝及未抗凝部分。RNA提取试剂Trizol，superscriptⅡ逆转录试剂盒，Taq DNA聚合酶为Invitrogen(Lifescience，USA)公司产品。DNA分子量标志为Takara(Japan)公司产品。

1.2 方法

1.2.1 PBMC总RNA的提取 取2 ml抗凝血与等体积磷酸盐缓冲液(PBS)充分混合，缓慢滴加于0.2 ml PBMC分离液中(6.4% Ficoll，9.9% sodium diatrizoate，0.07% NaCl)，2 000 r/min，水平离心20 min。以毛细吸管吸取中间层的PBMC至另一离心管中，加入3倍体积的PBS，1 500 r/min，离心10 min;重复洗涤细胞3次。加入1 ml TRizol试剂，按照说明书进行提取总RNA。同时，取1 g术中切除的子宫内膜组织提取组织总RNA。测定每个样本的A260/A280，判定所提取总RNA的纯度及浓度。

1.2.2 ck20 mRNA表达的RT-PCR检测 (1)引物设计：根究GenBank(NM_019010)发布的人ck20基因序列设计巢式引物：外部基因正向 (P1)：5'-GCGTTTATGGGGGTGCTGGAG-3'，反向(P2)：5'-GGCTCTGGGAGGTGCGTCTC-3';内部基因正向：(P3)：5'-CGGGGGGGACCTGTTTGT-3'，反向 (P4)：5'-CAGTGTTGCCCAGATGCTTGTG-3'。同时扩增 β-肌动蛋白(β-actin)基因为内参，正向 5'-ATCATGTTTGAGACCA-3';反向：5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'。(2)PCR：以 1 μl cDNA 为模板，P1、P2为引物进行首次扩增，94℃预变性5 min，94℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40 次循环，72 ℃最终延伸5 min。取首次扩增产物0.5 μl，P3、P4为引物进行二次扩增，退火温度变为62℃，其余条件同上。1.2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭(EB)染色对二次扩增产物进行鉴定，预期大小为485 bp。PCR产物经DNA序列分析证实为人ck20基因。β-actin基因PCR过程，94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，循环30次，72℃再延伸5 min。1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，预期大小为318 bp。

1.2.3 三种血清肿瘤标志物的ELISA测定 以所购买的血清CA125，CA15-3及SCCA ELISA试剂盒检测血清中三种肿瘤标志物的含量，按试剂盒说明书完成。采用国际通用标准判断结果是否为阳性，其中 CA125＞35 kU/L，CA15-3＞28 kU/L，SCCA＞1.5 mg/L确定为阳性。

1.3 统计学分析 计量资料采用t检验，计数资料采用 χ2检验。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增ck20 mRNA 所有样本均可有效扩增出β-actin基因。自子宫内膜组织及患者的外周血样本中可扩增出ck20基因，其片段大小与预期相符并经DNA序列分析确证，健康对照血样中未扩增出ck20基因。见图1。

2.2 ck20 mRNA在不同组别、不同阶段的分布 外周血样本中ck20 mRNA的检出率在良、恶性肿瘤间存在着明显的差异。子宫肌瘤及健康对照人群的血样中均无检出。而在三种恶性盆腔肿瘤组的术前血样中均有较高的阳性率〔子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌分别为 13例(76.4%)、7例(63.6%)、6例(42.9%)〕，且在不同类型的肿瘤中检出率差别较大(P＜0.05)。另外，恶性肿瘤组术后血样的检出率〔子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌分别为2例(11.8%)、3例(27.3%)、0例〕均较术前显著下降(P＜0.05)。

2.3 健康人群中三种血清肿瘤标志物的浓度 健康人群中CA125、CA15-3、SCCA 水平分别为(14.8 ±1.9)kU/L、(12.5 ±1.4)kU/L、(0.7±0.09)mg/L，均明显低于本文的阳性值。

2.4 四种肿瘤标志物在血液样本中的阳性分布 包括ck20 mRNA在内的四种肿瘤标志物在三种盆腔恶性肿瘤中均有较高的阳性检出率，且表现出一定的特征性分布。其中ck20在子宫内膜癌的阳性率远高于其他肿瘤，CA125在卵巢癌中的阳性率最高，SCCA阳性样本则以宫颈癌为主。18例良性肿瘤仅有1例表现出CA15-3的弱阳性(29.1 kU/L)，健康对照人群中无1例阳性结果，证明这4种肿瘤标志物对于恶性肿瘤的检测是特异的。见表1。

2.5 肿瘤标志物联合测定的价值 四种标志物联合测定，其阳性结果可以涵盖所有病例，大大降低漏诊率。见表2。

图1 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳

表1 各类患者血清CA125，CA15-3，SCCA及外周血ck20基因检测阳性率〔n(%)〕

表2 四项指标在手术病人中的综合分布〔n(%)〕

3 讨论

通过检测外周血中ck20 mRNA判定是否有侵袭入血的上皮细胞，已被用于包括肺癌、膀胱癌、结直肠癌等多种上皮性恶性肿瘤的诊断及预后评价〔4～6〕。最新的研究还表明，ck20基因在病灶部位的表达强弱还与宫颈癌的恶性程度相关〔7〕。为此，本文尝试将ck20 mRNA作为上皮性恶性肿瘤的外周血肿瘤标志物，与其他三种常用的妇科恶性肿瘤标志物相联合，用于临床患者的测定。结果证实了此检测方法的可行性;表明外周血ck20可以有效地作为恶性上皮性肿瘤的存在及评价预后的指标;临床上只有同时进行多种肿瘤标志物的联合测定才能够保证无漏诊之虞。

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