许 可 陈军全 (厦门大学生命科学学院，福建 厦门 36005)

翼状胬肉(Pterygium)是一种常见的眼表疾病，发病后可向中央角膜区移行，最终导致失明。与静止型的翼状胬肉相比，进展型的翼状胬肉表现出很强的向角膜中央区迁移的特点。基质金属蛋白酶(MMPs)可以降解细胞外基质(Eam)从而促进肿瘤细胞的迁移;在翼状胬肉中已发现MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-8、MMP-9 的表达上调〔1〕。在一些病理过程中，细胞分泌MMPs的同时也分泌MMPs特异性抑制因子(TIMPs)。壳寡糖是壳聚糖部分降解的产物，已有研究发现壳六糖可以产生明显的肿瘤抑制作用，当浓度为10 mg/kg时作用最强〔2〕。不仅如此，壳六糖对抑制肿瘤转移也表现出良好效果〔3〕。

1 材料与方法

1.1 材料 壳六糖购自大连中科格莱克生物技术有限公司，MMP-9和TIMP-1单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司。翼状胬肉由昆明第一医院提供。根据翼状胬肉的组织形态学特性，将其分为静止型(n=29)和进展型(n=20)。同时统计每个翼状胬肉组织对应患者的年龄、性别等信息。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 将新鲜的翼状胬肉组织切成均匀的两部分，一份用4%多聚甲醛固定后樱花冷冻包埋剂(OCT)包埋切片。切片厚度为6 μm。冰冻切片用4%多聚甲醛处理10 min，0.3%H2O2处理10 min消除内源性过氧化物酶活性。磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次后，用0.2%Triton X-100孵育15 min。PBS洗3次后，用2%牛血清白蛋白(BSA)封闭30 min。加一抗MMP-9(1∶50)4℃过夜孵育，加入二氨基联苯胺(DAB)试剂盒中对应的二抗，最后DAB显色。光镜下观察后，用清水冲洗，苏木素复染，中性树胶封片。

1.2.2 翼状胬肉原代细胞培养 取翼状胬肉组织块，利用添加双抗的PBS液浸泡15 min，PBS清洗2遍(每遍浸泡5 min)备用。用解剖剪将其剪成1～2 mm左右的小块。这些小组织块用SHEM培养基培养于37℃、5%(V/V)CO2的细胞培养箱中。2 d更换一次培养液。细胞贴壁生长近80%后，弃培养液，用PBS清洗后加入适量的胰酶消化。待贴壁细胞变圆后，加培养液终止，并离心收集细胞用于后续实验。〔后续研究均在MMP-9阳性表达的进展型翼状胬肉组织培养的血管周上皮样细胞(PECs)中进行〕。

1.2.3 细胞迁移实验 消化PECs细胞后，用PBS清洗离心，细胞悬浮于无血清的SHEM培养液中。5×104个细胞接种于Transwell小室，每孔100 μl。设空白对照组(PBS)和不同浓度的壳六糖样品组，下室加入体积分数为10% 新生牛血清的SHEM培养液。置37℃、5%(V/V)CO2的培养箱中，培养24 h后，弃去培养液，4%多聚甲醛4℃固定30 min，无菌水轻柔洗2次。用姬姆萨染料染色30 min后，用棉棒将膜上的细胞擦去，轻柔水洗，在显微镜下观察并统计。

1.2.4 RNA提取和cDNA合成 接种2.5×105个/ml的PECs细胞于6孔板中，每孔2 ml，分别以终浓度100 μg/ml壳六糖和PBS处理48 h后收集细胞，用TRIzol试剂提取细胞总RNA。获得的总RNA，以20 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解。紫外吸收法测定总RNA在吸光度260 nm和280 nm处吸收值，并计算其浓度和纯度。吸取总 RNA 2 μg，按 Invitrogen公司MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit说明书合成 cDNA，－20℃保存备用。

1.2.5 Real-time PCR 通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)查找人源的 MMP-9、TIMP-1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因，采用Premier5.0软件设计引物序列(表1)。Realtime PCR检测 MMP-9、TIMP-1、GAPDH基因表达水平。采用Bio-Rad IQTM5仪进行测定。GAPDH和 MMP-9、TIMP-1的PCR 反应体系均为 20 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μl，cDNA(稀释 5 倍)1 μl，2 × SYBR premixture 10 μl，用去离子水(ddH2O)补至20 μl。反应条件为95 ℃ 10 min，95 ℃变性15 s，55℃退火1 min，共40个循环。

表1 Real-time PCR引物序列

1.2.6 Western印迹 取1×106个翼状胬肉原代细胞在100 mm培养皿中培养24 h，分别以100 μg/ml壳六糖和PBS作用48 h后，收集细胞提取蛋白，取含有50 μg总蛋白的细胞裂解产物进行8%十二烷基硫酸钠-聚酰氨乙烯凝胶(SDS-PAGE)电泳，电泳后将蛋白转移到聚氟偏乙烯(PVDF)膜上，用含有5%脱脂奶粉的Tris盐酸缓冲液(TBST)溶液封闭PVDF膜1 h后，加入 TIMP-1(1∶100)和 MMP-9(1∶200)，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次15 min，二抗稀释液(1∶5 000)室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15 min，增强化学发光法(ECL)显影。

1.3 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行分析，数据资料以s表示，采用χ2检验和t检验进行处理。

2 结果

2.1 MMP-9在翼状胬肉中的表达 MMP-9在翼状胬肉上皮细胞中表达，并且在胞核和细胞质都有表达。在49例翼状胬肉组织中，19例(38.78%)阳性表达，30例(61.22%)阴性表达。MMP-9阳性表达者年龄〔(65.7±8.2)岁〕与阴性表达者年龄〔(61.3±6.3)岁〕无显著差异(P＞0.05)。MMP-9阳性表达中女性8例(42.11%)，男性11例(57.89%)(P＞0.05)。同时，阴性表达标本中女性 17例(56.67%)，男性 13例(43.33%)，亦无显著差异(P＞0.05)。进展型翼状胬肉占阳性表达标本总数的78.95%。而处于静止期的翼状胬肉标本主要集中于MMP-9阴性组(86.21%)。见图1。

2.2 壳六糖对翼状胬肉原代细胞迁移能力的影响 壳六糖浓度为 0、10、50、100、500、1 000 μg/ml时，PECs 迁移能力分别为1.02±0.14、0.9 ±0.16、0.7 ±0.08、0.46 ±0.08、0.41 ±0.03、0.42±0.08。10～1 000 μg/ml区间内壳六糖对PECs迁移力的抑制效果表现出剂量依赖性的特点。并且当壳六糖终浓度为1 000 μg/ml时，对PECs迁移能力表现出显著抑制。

2.3 在PECs中壳六糖对MMP-9、TIMP-1 mRNA水平的影响对照组 MMP-9、TIMP-1 mRNA分别为 1.04±0.11、1.14±0.13，壳六糖处理后的 PECs中 MMP-9 mRNA水平(0.41±0.07)显著下调，TIMP-1 mRNA水平(2.24±0.19)显著上调。Western印迹技术检测同样发现，壳六糖处理后的 PECs中MMP-9蛋白水平下调，TIMP-1蛋白表达显著上调。见图2。

图1 免疫细化检测翼状胬肉组织中MMP-9表达

图2 Western印迹检测100 μg/ml壳六糖处理后MMP-9、TIMP-1蛋白水平

3 讨论

翼状胬肉发病机制至今仍不十分清楚，但迁移相关的基因在翼状胬肉组织中阳性表达暗示迁移可能与其发病有关。壳六糖具有很好的生物活性，在抑制肿瘤发生和恶化方面的表现尤为突出，并且无明显的毒副作用。Shen等〔3〕在进行胃腺癌细胞系AGS、结肠癌细胞系COLO205、肝癌细胞系HepG2的研究中发现壳六糖具有抑制肿瘤细胞迁移的作用。基于以上几点，本文开展了壳六糖对翼状胬肉的研究。到目前为止，翼状胬肉没有公认的动物模型，因此以细胞模型作为研究对象，选择翼状胬肉病变程度高的组织块进行原代细胞培养。为避免人为因素的影响，挑选MMP-9(翼状胬肉发病相关基因)阳性表达的进展型翼状胬肉组织样品进行原代细胞培养。本研究发现，当剂量达到100 μg/ml时，壳六糖可有效抑制翼状胬肉原代上皮细胞(即PECs)的迁移。

MMPs是一类锌离子依赖的蛋白水解酶，可以水解ECM，在肿瘤细胞的转移和血管生成等多种病理过程中发挥着重要作用。近来发现，其成员之一的MMP-9在翼状胬肉中表达，在正常结膜和角膜缘处不表达〔4〕;同时，构成角膜上皮细胞基底膜成分的Ⅳ型胶原可以被MMP-9降解〔4〕。因此，推测壳六糖的作用可能和MMP-9的表达有一定关系。本研究结果表明，壳六糖确实抑制了MMP-9的表达。这与van Quang等〔5〕在人纤维肉瘤细胞HT1080中的发现一致。同时发现，MMP-9主要在迁移能力增强的进展型翼状胬肉中阳性表达，壳六糖可能通过抑制MMP-9的表达从而具备抑制翼状胬肉发展的功效。TIMPs是MMPs的主要抑制剂，其中TIMP-1在大部分的翼状胬肉组织中表达。本研究发现壳六糖可以促进TIMP-1的表达。有报道提到TIMP-1是MMP-9的特异性抑制剂〔6〕。本文的结果似乎表明在PECs上同样存在这种关系，同时，MMP-9还可刺激血管内皮生长因子(VEGF)的表达。通过对MMP-9和TIMP-1的作用，壳六糖可能不仅抑制基底膜的降解，阻止翼状胬肉迁移;同时参与抑制一些因子如VEGF(它可引起血管向角膜区长入〔7，8〕)的分泌。这一切都提示壳六糖可用于翼状胬肉治疗。

1 Yang SF，Lin CY，Yang PY，et al.Increased expression of gelatinase(MMP2 and MMP9)in pterygia and pterygium fibroblasts with disease progression and activation of protein kinase C〔J〕.Invest Oohthalmol Vis Sci，2009;50(10)：4588-96.

2 胡志鹏.壳寡糖的研究进展〔J〕.中国生化药物杂志，2003;24(4)：210-2.

3 Shen KT，Chen MH，Chan HY，et al.Inhibitory effects of chitooligosaccharides on tumor growth and metastasis〔J〕.Food Chemi Toxicol，2009;47(8)：1864-71.

4 Dushku N，John MK，Schultz GS，et al.Pterygia pathogenesis：corneal invasion by matrix metalloproteinase expressing alteredlimbal epithelial basal cells〔J〕.Arch Ophthalmol，2001;119(5)：695-706.

5 van Quang TA，Kim MM.Inhibitory effect of chitooligosaccharides on matrix metalloproteinase-9 in Human Fibrosarcoma Cells(HT1080)〔J〕.Mar Biotechnol(NY)，2006;8(6)：593-9.

6 Roderfeld M，Graf J，Giese B，et al.Latent MMP-9 is bound to TIMP －1 before secretion〔J〕.Biol Chem，2007;388(11)：1227-34.

7 陈嘉宁，黄巧玲，姜文浩.血管内皮生长因子在碱烧伤角膜新生血管中表达的研究〔J〕.中国老年学杂志，2005;25(9)：1006-8.

8 宋汉君，吕少春，李丽疆，等.红景天苷的抗肿瘤作用〔J〕.中国老年学杂志，2011;20：3991-2.