王 鹏 许 洁 安思训 于 顺 何 欣

(北华大学基础医学院人体解剖学教研室，吉林 吉林 132013)

帕金森病(PD)以路易小体(LB)和路易轴索(LN)的形成为主要病理特征。多项研究证实LB和LN可导致黑质多巴胺能神经元变性坏死，α-突触核蛋白(α-Syn)的变性聚集是形成LB和LN的关键。α-Syn与神经元内信号转导有关，参与突触形成、维持和神经元的分化，参与突触可塑性。在多巴胺能神经元中，α-Syn分布于胞体和轴突中，轴突中分布较胞体更为密集。在PD中，α-Syn作为LB和LN的主要成分也存在于细胞间。α-Syn功能片段包括N端(1～60)，含有两个PD突变位点(30＆53);NAC段，第61～95位氨基酸，已被确定是 Syn淀粉样变和纤维化过程重要片段;C端(96～140)，包含α-Syn家族特征性信息，可促进微管蛋白在体外合成微管〔1〕。本课题组前期研究发现，α-Syn可以增加神经元培养初期的存活率。本实验拟观察各片段对神经元生长的影响，旨在确定具有提高原代神经元存活率的片段，探讨α-Syn促进神经元生长的作用机制和PD的发病机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 马血清(HS)和胎牛血清(FBS)，购自Hy-Clone;蛋白分子量标准，购自Pharmacia公司;蛋白质定量试剂盒BCA Protein Assay Kit，购自Pierce Biotech;FITC标记的羊抗鼠抗体，购自中山公司;细胞培养基DMEM(F-12)，购自Gibco公司;α-Syn单克隆抗体及各片段的单克隆抗体，由首都医科大学宣武医院神经生物学研究室制备。其他均为化学分析纯。

1.2 实验动物 新生24 h的Wistar大鼠，不限雌雄，购自军事医学科学院实验动物中心，许可证号：SCXK-(军)。

1.3 方法

1.3.1 蛋白的纯化与定量 实验所用重组蛋白α-Syn、NAC段(61～95)、N端(1～60)、C端(96～140)，采用亲和层析法进行纯化。SDS-PAGE法鉴定，BCA法定量。

1.3.2 原代神经元培养 采用改良的原代培养方法〔2〕。新生24 h Wistar大鼠断头，取出鼠脑，置于D-Hank缓冲液中清洗，去除血管和脑膜，将皮质与髓质分离并剪成小块。以胰酶消化45 min，吹散并以筛网过滤。800 r/min离心2 min，弃上清，沉淀置于DMEM培养基中，混匀，并计数细胞密度。按0.75×105个/皿接种在培养皿中，加入相应蛋白进行分组培养。

1.3.3 神经元生长情况观察 培养至第1、2、4小时，在培养皿中加入终浓度为1%的戊二醛，固定1 h。随机挑选30个视野(每个视野有5个以上存活的神经元)，相差显微镜下观察并进行拍照。

1.3.4 Western印迹法鉴定 弃去培养基，缓冲液冲洗。用细胞刮刮下细胞，进行超声破碎，功率200 W，破碎30 s 2次，间歇30 s。破碎后加入 SDS-PAGE缓冲液，煮沸 5 min。4℃，12 000 r/min，离心20 min。转移上清，取35 μl作为样品，进行SDS-PAGE。结束电泳后，转膜，封闭，冲洗后，以1∶800比例稀释的相应抗体反应过夜。洗膜，再与1∶5 000稀释的生物素标记的羊抗鼠抗体溶液反应。冲洗后，ECL法显示条带。

1.3.5 免疫荧光法鉴定 室温下以戊二醛将培养细胞固定1 h，PBS冲洗。以含10%羊血清的PBST室温下封闭1 h。弃去封闭液，加入1∶5 000稀释的各片段抗体1.5 ml。4℃过夜后PBST冲洗。加入1∶500稀释的FITC标记羊抗鼠抗体，37℃2 h;吸弃反应液，冲洗。荧光显微镜下观察并照相。

1.3.6 培养分组方案 向培养基中添加N端、NAC段、C端和α-Syn，终浓度为20 μmol/L，同时用未添加蛋白作为对照组。设计浓度梯度，在培养集中加入20、40、60 μmol/L的各蛋白，观察在相关蛋白浓度增加后神经元生长的变化。

1.4 统计学分析 应用SPSS12.0软件进行正态性检验。多组样本均数比较采用方差分析，方差齐者两两比较采用LSD检验，方差不齐者用TamhanepT2检验。两组比较采用t检验。

2 结果

2.1 蛋白纯化鉴定 经SDS-PAGE鉴定，经亲和层析得到纯度较高的α-Syn和NAC、N端和C端。见图1。

图1 纯化后蛋白SDS-PAGE电泳图

2.2 C端提高原代培养神经元存活率，NAC段、N端对神经元生长无影响 见图2。培养至1、2 h，添加α-Syn组和C端组的神经元存活率大于对照组，N端组、NAC段组与对照组无差异(P＜0.05)。培养至4 h，α-Syn组神经元存活率明显大于对照组(P＜0.01)，C端组大于对照组(P＜0.05)，而N端组、NAC与对照组相比无差异(P＞0.05)。添加不同浓度的蛋白，培养至1、2、4 h，α-Syn组和C端组神经元存活率随蛋白浓度的增加而增加(P＜0.05)，而对照组和N端组、NAC组未见差异(P＞0.05)。可见C端具有与α-Syn相似的促原代神经元生长的功能，NAC段和N端无促突起生长功能。

图2 α-Syn和其功能片段对神经元突起生长的影响

2.3 增加蛋白片段C端的浓度，神经元的存活率提高 C端和N端能进入神经元，NAC段不能进入神经元。α-Syn组Western印迹结果可见清晰条带;N端组和C端组为弱阳性;对照组、NAC段组未见条带，阴性。免疫荧光显示，α-Syn组和C端组、N端组神经元显色清晰，NAC段组和对照组为阴性。见图3。

图3 α-Syn向细胞内的转运

3 讨论

原代培养的神经元经胰酶消化加机械吸打分离，其突起与胞体分离。破损的神经元细胞膜可自行愈合，添加入培养基中培养，开始贴壁生长。在培养基中添加α-Syn可以提高原代培养神经元的存活率，其可能的机制是它能够促进微管蛋白的聚合形成微管，微管系统铺助突起生长〔3～5〕，促进原代神经元在培养皿中贴壁生长。在原代神经元培养基内添加目的蛋白进行分组培养，证明在α-Syn中具有促神经元生长功能的片段是其C端，而N端和NAC段没有这一功能。而C端的促神经元生长的效应较α-Syn全长差。在培养基中增加C端的浓度，神经元的存活率升高，且具有浓度依赖关系。C端和N端可由培养基进入神经元中，而NAC段不能进入神经元中。

在α-Syn的功能片段中，C端可以进入神经元内并提高原代培养神经元细胞的存活率，增加其浓度可增高这一效应。N端可进入神经元，但不具备有促神经元生长功能。而NAC段不能进入神经元，也无促神经元生长功能。其可能的机制在于α-Syn C端含有众多带负电荷的氨基酸〔6，7〕，易与疏水基团结合，会以某种穿梭机制进入细胞并促进其生长。在PD中NAC已确定是淀粉样变和纤维化过程中不可缺少的，其73～83位氨基酸被认为是发生聚合的关键部位。本研究结果证实了α-Syn促原代神经元生长功能的功能片段位于蛋白的C端，确定了其剂量-效应关系，N端和NAC段无这一功能，为进一步解释PD的发生提供了新证据。

1 Alim MA，Hossain MS，Arima K.Tubulin seeds synuclein fibril formation〔J〕.Biol Chem，2002;277：2112-7.

2 邓小云，杨 眉，蔡 芳，等.一种改进的原代神经元的制备方法〔J〕.激光生物学报，2005;4(2)145-9.

3 Meloni MA，Galleri G，Camboni MG.Modeled microgravity affects motility and cytoskeletal structures〔J〕.Gravit Physiol，2004;11(2)：P197-8.

4 刘光伟，王 鹏.α-突触核蛋白促进大鼠原代培养神经元突起生长〔J〕. 首都医科大学学报，2009;30(5)：607-10.

5 Muhammad Abdul Alim，Qiu-lan Ma，Kazuya Takeda.Demonstration of a role for synuclein as a functional microtubule-associated protein〔J〕.J Alzheimer's Dis，2004;6：435-42.

6 Bussell R Jr，Eliezer D.A structural and functional role for 112mer repeats in alpha-synuclein and other exchangeable lipid binding proteins〔J〕.J Mol Biol，2003;329：763-78.

7 Keun JA，Seung RP，Kwang CC，et al.Amino acid sequence motifs and mechanistic features of the membrane translocation of α-synuclein〔J〕.J Neurochem，2006;97：265-79.