王若立 陈 晨 罗 红 孙文平 杨 光 (大连市友谊医院，辽宁 大连 600)

叉头转录因子(FoxO3a)属于转录因子FoxO家庭的成员，在维持免疫系统稳态上发挥重要作用〔1，2〕。FoxO3a基因缺失导致小鼠T细胞内细胞核转录因子(NF)-κB活性增高，引起T细胞自发性增殖和多组织器官的慢性炎性细胞浸润〔3〕。慢性炎性病变局部主要以单核巨噬细胞浸润为主，产生大量炎性趋化因子诱导炎性细胞进一步浸润。目前关于FoxO3a是否参与单核巨噬细胞的分化及功能调控尚不十分清楚。本研究探讨FoxO3a基因缺失对于巨噬细胞功能相关抗原-1(Mac-1+)细胞分化及功能的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 FoxO3a基因敲除鼠由日本长寿医疗研究中心提供，所有小鼠均为C57BL/6品系。基因敲除鼠的建立参见文献〔4〕。所有实验均选取适龄雌性小鼠。对照小鼠均为与基因敲除鼠同窝出生的野生型鼠。所有小鼠在无特定病原体(SPF)级动物室饲育，实验严格遵守动物实验伦理要求。

1.2 方法

1.2.1 脾细胞制备 颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏放入4℃Hank液(Sigma公司)中，置于100 μm无菌细胞过滤网(BD Falcon公司)，用注射器针芯研压脾脏，获得脾细胞悬液，离心后弃上清，加入红细胞裂解液(EDTA-NH4Cl)置于冰上1 min，立即用10%胎牛血清(FBS)RPMI培养液(Gibco公司)洗涤细胞2次后，将细胞悬浮于10%FBS RPMI培养液中。所有离心条件均为 1 200 r/min，5 min。

1.2.2 细胞染色 取脾细胞3×105，分别用异硫氰酸荧光素(FITC)-anti-CD8(53-6.7)和聚乙烯荧光素(PE)-anti-CD4(RM4-5)、FITC-anti-B220(RA3-6B2)和 PE-anti-CD3(17A2)及FITC-anti-B220(RA3-6B2)和PE-anti-CD11b(M1/70)三组抗体进行染色，用含0.05%NaN3及4%FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，用40 μm Nylon Mesh(BD Falcon公司)过滤后，将细胞悬浮于含5 μg/ml碘化丙啶(PI，Sigma公司)的上述缓冲液中，以上抗体均购自美国BD Pharmingen公司。用流式细胞仪FACSCalibur(美国BD Biosciences公司)对染色后细胞进行分析。

1.2.3 细胞分选 收集40×107个脾细胞，用FITC-anti-B220(RA3-6B2)和PE-anti-CD4(RM4-5)抗体染色后，使用日本Bay Bioscience JSAN流式细胞分选仪获得CD4+T细胞和B细胞，纯度分别为98.5%和98.7%。回收未着染细胞，用FITC-anti-B220(RA3-6B2)和PE-anti-CD11b(M1/70)抗体染色后，使用上述分选仪获得Mac-1+细胞，纯度为99%。回收未着染细胞，用FITC-anti-CD8(53-6.7)和PE-anti-CD4(RM4-5)抗体染色后，使用上述分选仪获得CD8+T细胞，纯度为98.7%。

1.2.4 RNA提取及Real-time PCR 取1×107个细胞，用PBS洗涤2次，溶于1 000 μl TRIzol Reagent(Invitrogen公司)中，提取总RNA。使用反转录试剂盒(Promega公司)合成cDNA。使用QuantiTect SYBR Green PCR Kit(QIAGEN公司)对目标基因mRNA表达进行定量。S100A8上游引物：5'-ATACAAGGAAATCACCATGC-3';下游引物：5'-TACTCCTTGTGGCTGTCTTT-3';S100A9上游引物：5'-AGCAAGAAGGAATTCAGACA-3';下游引物：5'-TCAGCATCATACACTCCTCA-3';EF1a上游引物：5'-TGCTGCCATTGTTGATATGG-3';下游引物：5'-TCCACAGCTTTGATGACACC-3'。PCR条件为：95℃预变性10 min;95℃ 15 s，55℃ 25 s，72℃ 10 s，40 个循环;72℃ 延伸 5 min，结束反应，4℃保存。

1.2.5 Western印迹 取1×107个脾细胞，用冷PBS洗涤2次，溶解于 500 μl IP Kinase 液(150 mmol/L Nacl，2.5 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L HEPES，0.1%Tween-20，10%glycerol)中，经超声波破碎后获得脾细胞溶解液，使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒(Thermo Pierce公司)对蛋白质进行定量。等量样品进行7.5%和12.5%十二烷基硫酸钠-聚乙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司)。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗Anti-FOXO(Upstate 公司#06-951，1∶1 500)或 Anti-S100A9(abcam 公司 ab75478，1∶1 000)，4℃过夜。用含 0.05%Tween-20的 PBS溶液洗涤 3次各 10 min后加入二抗 Anti-rabbit(Sigma，1∶4 000)，室温孵育30 min，再用上述PBS溶液洗涤3次，最后使用增强化学发光法(ECL)发光试剂盒(Thermo Pierce公司)和X光胶片(柯达公司)显色。一抗还包括Anti-tubulin(Sigma T6557，1∶2 000)。

1.3 统计学方法 应用SPSS10.0统计软件行t检验。

2 结果

2.1 FoxO3a基因缺失导致小鼠脾脏中Mac-1+细胞数明显增加 基因敲除鼠的肺及皮下等组织内可见大量炎性细胞浸润，脾脏随年龄增加而明显肥大。流式细胞术分析。发现FoxO3a基因敲除鼠脾细胞总数明显增加(P＜0.05)，其中T、B淋巴细胞表现了相同比例的增加(P＜0.05)，而Mac-1+细胞数量及百分率的增加更加明显(P＜0.05)。见表1。

表1 FoxO3a基因敲除鼠与野生型小鼠脾细胞构成比较(s)

表1 FoxO3a基因敲除鼠与野生型小鼠脾细胞构成比较(s)

与野生型组比较：1)P＜0.05

组别 总数(×106)CD3+(%)B220+(%)Mac-1+(%)计数(×106)CD3+ B220+ CD4+ CD8+ Mac-1+1±2.7 8.3±2.5 4.6±2.0基因敲除组 148±14.01) 31±5.0 38±6.4 14±4.91) 45±5.31) 57±111) 22±4.21) 17±2.21) 20±71)野生型组 61±17.0 37±3.5 46±1.3 7.3±1.0 22±4.9 28±8.1 1

2.2 Mac-1+细胞内炎性细胞因子S100A8和S100A9基因表达明显高于对照鼠 利用流式细胞分选技术从各组小鼠脾细胞中获得高纯度的Mac-1+细胞，纯度达到99%。Real-time PCR结果显示基因敲除鼠脾脏Mac-1+细胞内的S100A8和S100A9 mRNA表达(9.34±1.31，11.5±1.12)分别是野生型小鼠(1.36±0.31，1.00±0.08)的6.87、11.5 倍，明显高于对照鼠。

2.3 FoxO3a基因敲除鼠脾脏S100A8、S100A9蛋白表达明显高于正常对照鼠 由于脾细胞中S100A8和S100A9仅在Mac-1+细胞中表达，分别制备了FoxO3a基因敲除鼠及对照鼠的脾细胞溶解液。基因敲除鼠较野生型鼠S100A8(9.86±1.33 vs 1.02±0.27)和S100A9基因(8.78±1.31 vs 1.14±0.10)分别高出9.86、8.78倍。Western印迹分析显示基因敲除鼠脾细胞中S100A8、S100A9的蛋白表达亦明显增加。在脾细胞各组份中，仅有Mac-1+细胞表达S100A8及S100A9基因。基因敲除鼠脾细胞、野生型鼠Mac-1+细胞和基因敲除鼠Mac-1+细胞的S100A9 mRNA表达(8.78±1.31、2.81±0.22、32.33±3.15)分别为野生型小鼠脾细胞S100A9 mRNA检出量(1.14±0.10)的8.78、2.91、31.9倍，而其他各细胞组分的检出量近似于0。同时，基因敲除鼠脾细胞、野生型小鼠Mac-1+细胞和基因敲除鼠Mac-1+细胞的 S100A8 mRNA表达(9.86±1.33、13.25±12.74、90.82±30.98)分别为野生型小鼠脾细胞S100A8 mRNA检出量(1.02±0.27)的9.86、13.5和87.6倍，而其他各细胞组分的检出量接近于0。见图1。

图1 小鼠脾细胞中S100A8及S100A9蛋白表达

2.4 S100A8和S100A9基因启动子部位未发现已知的FoxO的DNA特异性识别序列 由于FoxO3a基因缺失导致Mac-1+细胞中S100A8和S100A9 mRNA的表达异常升高，为了明确FoxO3a是否直接参与S100A8和S100A9基因的表达调控，对小鼠S100A8和S100A9基因转录起始点上游500 bp的基因序列进行分析，未发现有DNA识别序列〔(G/C)(T/A)AAA(C/T)AA〕，仅显示了小鼠S100A8基因转录起始点上游91 bp序列和S100A9基因转录起始点上游80 bp序列。见图2。

图2 小鼠S100A8及S100A9基因启动子序列分析

3 讨论

最近有报道显示在特异性免疫应答过程中FoxO3a参与树突细胞的功能调控〔5〕，FoxO3a基因缺失可以导致树突细胞过度活化产生大量IL-6进而诱导T细胞过度增殖。还有研究发现调节性T细胞的标志性基因Foxp3为FoxO靶基因，FoxO基因缺失可导致Foxp3的表达抑制，使调节性T细胞发育障碍，数量减少〔1，2〕。此外还有证据显示FoxO3a可参与淋巴细胞及中性粒细胞的凋亡调控〔6〕。可见，FoxO家族在免疫系统功能调控中具有重要作用。

FoxO3a基因缺失引起多种免疫细胞(效应性T细胞、树突细胞及调节性T细胞)功能异常，可能是导致小鼠T细胞自发性活化增殖以及多器官慢性炎性细胞浸润的重要原因。然而，目前普遍认为单核巨噬细胞在慢性炎症性疾病中发挥更为重要的作用〔7〕。慢性炎性病变局部主要以单核巨噬细胞浸润为主，其产生大量炎性趋化因子可以持续诱导炎性细胞浸润。基因芯片分析显示，人单核细胞进入局部组织向巨噬细胞分化过程中FoxO3a的表达降低〔8〕，提示FoxO3a可能在单核巨噬细胞的分化过程中发挥重要作用。FoxO3a基因敲除鼠表现的炎性反应局部明显的Mac-1+细胞增加，亦提示FoxO3a可能参与单核巨噬细胞的功能调控。另外，FoxO3a基因缺失小鼠脾脏内Mac-1+细胞中S100A8和S100A9基因表达增高，提示FoxO3a可能有抑制单核巨噬细胞过度活化、维持其稳态的作用，或者与S100A8和S100A9的基因表达调控有关。尽管小鼠S100A8和S100A9基因启动子部位尚未发现已知的FoxO的DNA特异性识别序列，但由于FoxO还可以通过与其他转录因子相互作用调节靶基因表达，因此，并不能排除S100A8和S100A9为FoxO3a靶基因的可能，有待进一步验证。

1 Ouyang W，Beckett O，Ma Q，et al.Foxo proteins cooperatively control the differentiation of Foxp3+regulatory T cells〔J〕.Nat Immunol，2010;11(7)：618-27.

2 Harada Y，Harada Y，Elly C，et al.Transcription factors Foxo3a and Foxo1 couple the E3 ligase Cbl-b to the induction of Foxp3 expression in induced regulatory T cells〔J〕.J Exp med，2010;207(7)：1381-91.

3 Lin L，Hron JD，Peng SL，et al.Regulation of NF-kappaB，Th activation，and autoinflammation by the forkhead transcription factor Foxo3a〔J〕.Immunity，2004;21(2)：203-13.

4 Miyamoto K，Araki KY，Naka K，et al.Foxo3a is essential for maintenance of hematopoietic stem cell pool〔J〕.Cell Stem Cell，2007;1(1)：101-12.

5 Dejean AS，Beisner DR，Chen IL，et al.Transcription factor Foxo3 controls the magnitude of T cell immune responses by modulating the function of dendritic cells〔J〕.Nat Immunol，2009;10(5)：504-13.

6 You H，Pellegrini M，Tsuchihara K，et al.FOXO3a-dependent regulation of Puma in response to cytokine/growth factor withdrawal〔J〕.J Exp Med，2006;203(7)：1657-63.

7 Liu H，Shi B，Huang CC，et al.Transcriptional diversity during monocyte to macrophage differentiation〔J〕.Immunol lett，2008;117(1)：70-80.

8 Cui M，Huang Y，Zhao Y，et al.Transcription factor FOXO3a mediates apoptosis in HIV-1-infected macrophages〔J〕.J Immunol，2008;180(2)：898-906.