王 颖 张桂芳 常咏涵 姚 笛 (黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 6339)

糖尿病已经成为现代社会中的一种发病率极高的疾病，并发症颇多，近年来发病率上升很快，严重影响患者生存质量，并造成极重的社会负担〔1〕。临床上常用的治疗糖尿病的西药毒副作用较多，寻找更为有效、安全和廉价的降糖药物成现代医学的重要任务。苦瓜甙类物质有快速降糖，调节胰岛功能，修复β细胞，增加胰岛素的敏感性，预防改善并发症，调节血脂，提高免疫力的作用。为进一步验证其功效，本实验通过灌喂不同剂量的苦瓜甙来研究其对四氧嘧啶糖尿小鼠的降血糖作用和机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明小鼠，雄性，体重20～25 g，自由摄食饮水，所用饲料为标准鼠饲料，由长春生物制品厂提供。

1.2 实验材料及试剂 苦瓜甙(本实验室制备)，实验前用蒸馏水配制成所需浓度;格列本脲(国药准字H11020883，北京太洋药业有限公司);四氧嘧啶(ALX，上海亿欣生物科技有限公司);怡成血糖测试仪及测定试纸(北京怡成生物电子技术有限公司);丙二醛(MDA)测定试剂盒，超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒和还原性谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究院，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 ALX诱导小鼠糖尿病模型的建立方法 取小鼠50只适应性喂养1 w后，随机抽取10只作为正常对照组，其余40只随机分为4组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组)，每组10只，作为ALX诱导糖尿病模型组。糖尿病模型组小鼠禁食不禁水12 h后，腹腔注射ALX，以生理盐水配制成2%溶液(现配现用)，每日1次，连续注射4 d，剂量分别为120，100，80 mg/kg和60 mg/kg。正常对照组注射等量生理盐水。糖尿病诱导期间，分别在第2天，第3天和第4天注射4 h后，进行尾部静脉采血，测空腹血糖值，观察血糖升高情况，末次注射72 h后测空腹血糖值，方法参照文献〔2〕，选取空腹血糖值≥11.1 mmol/L的小鼠作为糖尿病模型。

1.4 实验动物的分组方法 健康小鼠80只，适应性喂养1 w后，随机抽取10只作为正常对照组(BD组)，其余按最佳工作浓度腹腔注射ALX诱导糖尿病模型，末次注射72 h后尾静脉采血，将空腹血糖值≥11.1 mmol/L的小鼠随机分为5组，每组10只，并分别标记为模型对照组(MoD)，苦瓜甙低剂量组(LD)，苦瓜甙中剂量组(MD)和苦瓜甙高剂量组(HD)。

1.5 实验动物的给药方法 给药方法为灌胃给药(ig)，每日1次，连续给药21 d，观察小鼠体征变化;灌喂当天测定小鼠体重和空腹血糖，试验期间在每周末的同一时间测定小鼠体重，各组小鼠空腹8 h后采尾静脉血测定血糖。见表1。

表1 实验动物的药剂分配

1.6 ALX糖尿病小鼠葡萄糖耐受量的测定方法 将ALX诱导糖尿病模型小鼠(MoD，LD，MD，HD)于末次给药后禁食4 h，经口给予葡萄糖2.5 g/kg，分别在葡萄糖灌喂后的0，30，60，120 min进行尾静脉采血，测血糖值。观察MoD组与LD，MD，HD组给予葡萄糖后各时间点血糖曲线下面积变化〔3〕。

1.7 检测指标 灌喂试验结束，禁食16 h后摘除小鼠眼球取血，将血液迅速在4℃下离心分离血清，测血糖、MDA含量、SOD活性和GSH含量。

1.8 统计学方法 应用SPSS11.0统计软件，计量资料以s表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 ALX诱导小鼠糖尿病模型的建立 腹腔注射到第2、3、4天时，可以有效诱导小鼠血糖升高，且稳定性较好。但在第3及第4天时，小鼠死亡率呈上升趋势并且较高，不适合作为药物筛选的动物模型。到第2天为止小鼠的死亡率较低，适于药物筛选，因此选择第1天腹腔注射浓度为120 mg/kg的ALX，次日追加浓度为100 mg/kg的ALX用于本实验糖尿病模型的制备。见表2，表3。

2.2 苦瓜甙对ALX糖尿小鼠体重的影响 正常对照组小鼠的体重在试验期间稳定增加，而在1 w内所有糖尿小鼠的体重均有所下降，说明糖尿组小鼠出现高消耗临床症状。经过21 d的灌喂实验，模型对照组小鼠的体重持续下降，并有个别死亡;苦瓜甙低、中剂量组小鼠的体重虽然仍低于初始体重，但随着实验的进行体重均有所回升;给药结束时苦瓜甙高剂量组小鼠的体重与模型对照组相比增加显著(P＜0.05)，与阳性对照组小鼠的体重接近。见图1。

2.3 苦瓜甙对ALX糖尿小鼠空腹血糖的影响 给药前与正常对照组相比，所有糖尿组小鼠的血糖值均显著高于正常对照组小鼠，说明糖尿病诱导效果显著;随着实验的进行，模型对照组小鼠血糖值虽然趋于平稳，仍保持在一个较高的水平;给药14 d后，苦瓜甙高剂量组小鼠的血糖值明显下降，与模型对照组相比差异显著(P＜0.05);给药结束时苦瓜甙实验组的血糖值均低于给药前，与模型对照组小鼠相比差异显著，苦瓜甙高剂量组小鼠的降糖率高达24.48%，与阳性对照组的降糖效果接近。见图2。

2.4 苦瓜甙对ALX糖尿小鼠葡萄糖耐受量的影响 苦瓜甙、低、中高剂量下，均可明显抑制四氧嘧啶高糖小鼠葡萄糖负荷后血糖的升高(P＜0.05)，同时可明显减少血糖曲线下面积，对照组(34.2 ±3.1)mmol·L－1·h－1，苦瓜甙低、中、高剂量组分别为(29.5±2.8)，(25.6 ±3.5)和(21.2±3.2)mmol·L－1·h－1。见图 3。

表2 不同浓度ALX处理后小鼠血糖浓度变化( s ，mmol/L)

表2 不同浓度ALX处理后小鼠血糖浓度变化( s ，mmol/L)

组别 第1天 第2天 第3天 第4天正常对照组5.90±0.62 5.80±0.55 6.00±0.81 5.90±0.73Ⅰ组 5.92±0.47 11.80±1.12 13.50±0.44 16.40±1.65Ⅱ组 5.93±0.80 11.40±0.99 12.00±0.87 17.00±1.97Ⅲ组 5.90±0.64 12.50±1.33 14.40±1.31 17.50±1.66Ⅳ组5.94±0.88 10.90±0.98 14.00±1.18 19.00±1.59

表3 不同浓度ALX处理小鼠后的死亡率

表4 苦瓜甙对ALX糖尿病小鼠血清MDA、SOD和GSH水平的影响(s)

表4 苦瓜甙对ALX糖尿病小鼠血清MDA、SOD和GSH水平的影响(s)

与模型组比较：1)P ＜0.01，2)P ＜0.05

组别 MDA(nmol/L)SOD(U/ml)GSH(mg/L)1.99±0.94 61.3±8.6 178.3±16.3 MoD组 3.64±0.41 44.2±9.1 112.0±16.8 LD组 2.24±1.311) 57.6±3.42) 166.9±21.41)MD组 3.25±0.89 45.8±5.6 119.0±9.92)HD组 2.89±0.592) 47.2±4.3 148.1±15.82)BD组

2.5 苦瓜甙对ALX糖尿小鼠血清抗氧化分子含量和活性的影响 见表4。糖尿病小鼠的血清MDA水平明显增加，血清SOD水平明显降低，均与正常对照组小鼠存在明显差异。说明糖尿病小鼠抗氧化防御体系受到四氧嘧啶的影响，氧化应激增加，自由基产生率大于清除率。通过一定时间的苦瓜甙灌喂，糖尿病小鼠血清的SOD水平呈上升趋势，且显著高于糖尿病对照组，同时血清MDA水平明显降低，其中苦瓜甙高剂量组MDA水平下降趋势更明显 (P＜0.05)。说明苦瓜甙缓解了这种氧化应激，对氧化应激损伤可能具有保护作用。值得注意的是苦瓜甙使血清GSH这种抗氧化分子活性升高，提示其可能具有抗氧化作用，避免或延缓了抗氧化分子的耗竭。

图1 苦瓜甙对ALX糖尿病小鼠体重的影响

图2 苦瓜甙对ALX糖尿病小鼠血糖的影响

图3 苦瓜甙对ALX糖尿病小鼠葡萄糖耐受量的影响

3 讨论

四氧嘧啶是一种特异性的胰岛β-细胞毒剂，可以引起与人类相似的糖尿病模型，其原理是四氧嘧啶在体内可选择性被胰腺β细胞吸收，所产生的过量自由基能够直接破坏β细胞的结构，导致小鼠的胰腺损伤和坏死，降低体内胰岛素水平，使血糖明显升高。而长期处于高血糖状态下的小鼠由于氧化应激作用，进一步导致小鼠机体抗氧化防御体系的失衡，引发一系列糖尿病并发症〔4，5〕。本实验采用二次追加剂量腹腔注射四氧嘧啶的方法诱导小鼠糖尿病模型，对小鼠的血糖值变化及死亡率进行了分析。在初期造模的研究过程中，注射第3天开始小鼠死亡率明显上升，这表明在制备糖尿病模型时四氧嘧啶的浓度过高很可能导致毒物在体内堆积，胰腺损伤严重，高血糖进一步引起了机体抗氧化防御体系的失衡，最终导致死亡。故本实验选择第1天注射四氧嘧啶剂量为120 mg/kg，次日追加100 mg/kg，在该剂量下，注射 72 h后小鼠血糖值均高于11.1 mmol/L的标准，并且小鼠的死亡率较低，便于观察苦瓜甙的治疗效果。在试验初期，糖尿病小鼠均出现了毛色发黄，精神不振;体重下降，摄食量、饮水量增加的临床症状，而经过一段时间的苦瓜甙灌喂给药，糖尿小鼠的“三多一少”症状得到缓解。由于对糖尿病的发病机制尚未充分阐明，目前在糖尿病的治疗过程中，控制血糖水平仍是治疗的首要目标，持续性高血糖会殃及全身组织、器官及细胞，并引发慢性并发症。本研究中苦瓜甙能够降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的空腹血糖值，改善受损的糖耐受量，其中苦瓜甙高剂量组的降糖效果最为显著。提示苦瓜甙能有效控制糖尿病小鼠的血糖水平，缓解高血糖所导致的机体防御系统失衡，进而降低糖尿病并发症的发生率〔6，7〕。而通过一段时间的苦瓜甙灌喂治疗，小鼠血清MDA水平下降，血清SOD活性和GSH含量有所提高，说明苦瓜甙降血糖的机制可能与其所具有的抗氧化作用可以减弱自由基对胰岛β细胞的攻击有关〔8〕。

1 Zachary T.Diabetic retinopathy and diabetic neuropathy〔J〕.Diabetes Care，2007;30(3)：760-5.

2 徐淑云，卞如濂，陈修.药理实验方法学〔M〕.第2版.北京：人民卫生出版社，1994：1269-85.

3 杜冠华.实验药理学〔M〕.北京：中国协和医科大学出版社，2004：372-5.

4 Robertson RP.Chronic oxidative stress as a central mechanism for glucose toxicity in pancreatic islet beta cells in diabetes〔J〕.Biol Chem，2004;279(41)：42351-4.

5 吴建中，欧仕益.番石榴多糖对糖尿病小鼠的血糖及抗氧化能力的影响〔J〕.中成药，2007;29(5)：668-71.

6 姜宏卫，李长贵，董砚虎.苦瓜属植物治疗糖尿病研究进展〔J〕.现代中西结合杂志，2002;11(2)：127.

7 朱晶英.苦瓜伤流液降血糖功效及其作用机制研究〔D〕.江苏大学，2010.

8 毛童俊，陈伟平，高秋萍，等.蚕蛹油对糖尿病大鼠血糖及氧化应激的影响〔J〕. 营养学报，2010;32(3)：253-6.