杨文超，陈湖南，缪晓青*

(福建农林大学蜂学学院，福建 福州 350002)

莲花蜂花粉酶解破壁工艺条件优化

杨文超，陈湖南，缪晓青*

(福建农林大学蜂学学院，福建 福州 350002)

为研究莲花蜂花粉的最佳酶解破壁条件，通过单因素试验确定纤维素酶-果胶酶-木聚糖酶-木瓜蛋白酶4种酶制剂的比例，在酶解破壁条件的单因素试验基础上，采用二次回归正交旋转组合设计试验方法对酶解条件进行优化，建立酶解pH值、复合酶加入量、酶解温度、料水比与破壁率之间的经验数学模型。复合酶中各种酶制剂的最适配比为4:2:1:3。莲花蜂花粉酶解破壁的最佳条件为酶解pH4.0、复合酶加入量12‰、酶解温度45℃、料水比1:14(g/mL)，破壁率89.21%。

莲花蜂花粉；酶制剂；破壁

蜂花粉是蜜蜂采集植物花粉形成的花粉团，具有增强人体免疫力、抗疲劳、美容、延缓衰老和治疗前列腺疾病等作用[1-2]。由于花粉壁具有异常耐酸耐碱耐腐蚀的坚硬外壁，将其应用于食品中一般要对花粉进行破壁处理，使其所含营养成分充分地释放出来。蜂花粉的破壁方法有很多，常见的有机械破壁、温差破壁、发酵破壁、超临界二氧化碳、超微粉碎、液氮淬冷法和单一酶破壁等[3-18]。这些方法普遍存在一些缺点，如营养物质损失多、破壁率不理想、破壁时间长而且易污染。酶解破壁具有反应条件温和、高效率、破壁率高等优点，为探索较好的破壁方法，采用单因素试验和正交旋转试验，利用多种生物酶组成的复合酶体系对蜂花粉进行酶解破壁研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

莲花蜂花粉 福建省神蜂科技开发有限公司；纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶和木聚糖酶 天津市诺奥科技公司；酒石酸、柠檬酸均为食品级。

1.2 仪器与设备

pH计 上海伟业仪器厂；生化培养箱 上海博迅公司；生物显微镜 重庆奥特公司；真空干燥箱 上海精宏公司；箱式电阻炉 天津市泰斯特公司；自动凯氏定氮仪 上海纤检公司；紫外-可见分光光度计 北京瑞利公司。

1.3 方法

1.3.1 复合酶体系中各种酶制剂的配比试验

破壁条件：pH4.0、温度45℃、料水比1:9、酶解时间12h。

1.3.1.1 纤维素酶加入量对花粉破壁率的影响

研究不同纤维素酶加入量(0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)对花粉破壁率的影响。

1.3.1.2 果胶酶加入量对花粉破壁率的影响

在确定最佳纤维素酶加入量的基础上，研究不同果胶酶加入量(0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)对花粉破壁率的影响。

1.3.1.3 木聚糖酶加入量对花粉破壁率的影响

确定最佳纤维素酶和果胶酶加入量的基础上，研究不同木聚糖酶加入量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)对花粉破壁率的影响。

1.3.1.4 木瓜蛋白酶加入量对花粉破壁率的影响

确定最佳纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶加入量的基础上，研究不同木瓜蛋白酶加入量(0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)对花粉破壁率的影响。

1.3.2 复合酶破壁的单因素试验

1.3.2.1 酶解pH值对花粉破壁率的影响

酶解pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，条件为复合酶加入量12‰，料水比1:9，45℃条件下酶解时间6h。比较不同pH值条件下的花粉破壁率。

1.3.2.2 复合酶加入量对花粉破壁率的影响

复合酶加入量分别为0.4‰、2‰、4‰、8‰、12‰、16‰，条件为pH4.5、料水比1:9、45℃条件下酶解时间6h。

1.3.2.3 酶解温度对花粉破壁率的影响

酶解温度分别为35、40、45、50、55℃，条件为pH4.5，复合酶加入量12‰，料水比1:9，酶解时间6h。

1.3.2.4 料水比对花粉破壁率的影响

料水比分别为1:6、1:9、1:12、1:15，条件为pH4.5，复合酶加入量12‰，在45℃条件下酶解时间6h。

1.3.2.5 酶解时间对花粉破壁率的影响

酶解时间分别为4、6、8、10、12h；条件为pH4.5，复合酶加入量12‰，料水比1:9，酶解温度45℃。

1.3.3 二次回归正交旋转组合设计试验

在上述单因素试验的基础上，选出五因素(酶解pH值、复合酶加入量、酶解温度、料水比、酶解时间)中的主要因素，进行二次回归正交旋转组合设计试验重点研究，以花粉破壁率为指标，优化莲花蜂花粉破壁工艺参数[19]。

1.3.4 破壁率测定

取莲花蜂花粉样品1g，加蒸馏水10mL，制成10%的花粉液，制作玻片，置于显微镜下观察。制作3个玻片，每片5个视野，统计计算破壁率。

1.3.5 理化指标测定

单一花粉率测定：计数法，参考GH/T 1014—1999《蜂花粉》；水分测定：真空干燥法，参考GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》；灰分测定：高温燃烧法，参考GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》；蛋白质测定：凯氏定氮法，参考GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》；还原糖测定：直接滴定法，参考GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》；VC测定：2,4-二硝基苯肼法，参考GB/T 5009.86—2003《蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定》。1.3.6 数据处理与统计分析

采用DPS软件对数据进行显著性分析，以P＜0.05为显著性标准。

2 结果与分析

2.1 莲花蜂花粉破壁前后的特征

在10×10显微镜下观察莲花蜂花粉破壁前后的细胞图，见图1。

图1 破壁前(A)和破壁后(B)的莲花蜂花粉Fig.1 Microscopic observation of intact (A) and disrupted (B) lotus bee pollen cells

2.2 复合酶体系中各种酶制剂的配比试验

2.2.1 纤维素酶加入量对花粉破壁率的影响

图2 纤维素酶加入量对花粉破壁率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis with different dosages of cellulase alone on the disruption of lotus bee pollen cell walls

纤维素酶能消解花粉壁内壁的纤维素，花粉壁破裂并促使内容物溢出，所以其加入量对莲花花粉破壁影响很大，破壁率随着纤维素酶加入量的增大而显著升高。由图2可知，随着纤维素酶的增加，莲花蜂花粉的破壁率逐渐增加，当纤维素酶加入量为0.8%和1.0%时，花粉破壁率提升很小，选择0.8%为纤维素酶最适加量。

2.2.2 果胶酶加入量对花粉破壁率的影响

图3 果胶酶加入量对花粉破壁率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis with 0.8% celluase and different dosages of pectinase on the disruption of lotus bee pollen cell walls

果胶酶同样可以分解划分内壁的果胶质，促使花粉破壁。由图3可知，纤维素酶最适量0.8%，果胶酶加入量对莲花花粉破壁率具有显著作用。当果胶酶加入量为0.4%时，花粉破壁率达到最高，0.4%为果胶酶最适加入量。

2.2.3 木聚糖酶加入量对花粉破壁率的影响

图4 木聚糖酶加入量对花粉破壁率的影响Fig.4 Effect of hydrolysis with 0.8% celluase, 0.4% pectinase and different dosages of xylanase on the disruption of lotus bee pollen cell walls

木聚糖酶可以分解花粉的细胞壁以及β-葡聚糖，降低物料的粘度，促进有效物质的释放，并能降低其中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，因而更易取得可溶性脂类成分。由图4可知，添加纤维素酶0.8%和果胶酶0.4%，在木聚糖酶加入量为0.1%～0.2%时，莲花花粉的破壁率提高明显；而加入量大于0.2%后，花粉破壁率基本不变，选择0.2%为木聚糖酶的最适加入量。

2.2.4 木瓜蛋白酶加入量对花粉破壁率的影响

图5 木瓜蛋白酶加入量对花粉破壁率的影响Fig.5 Effect of hydrolysis with 0.8% celluase, 0.4% pectinase, 0.2% xylanase and different dosages of papain on the disruption of lotus bee pollen cell walls

木瓜蛋白酶是一种含疏基(—SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。木瓜蛋白酶的添加，可使花粉内壁蛋白质得以分解，促使花粉破壁。由图5可知，分别加纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶最适量0.8%、0.4%和0.2%时，莲花花粉破壁率受木瓜蛋白酶影响显著。当木瓜蛋白加入量为0.6%时，花粉破壁率最大。因此选择0.6%作为木瓜蛋白酶的最适加入量。

4种酶制剂的最适加入量配比为纤维素酶(0.8%):果胶酶(0.4%):木聚糖酶(0.2%):木瓜蛋白酶(0.6%)＝4:2:1:3。

2.3 莲花蜂花粉破壁单因素试验结果

2.3.1 酶解pH值对花粉破壁率的影响

图6 酶解pH值对花粉破壁率的影响Fig.6 Effect of hydrolysis pH on the disruption of lotus bee pollen cell walls

由图6可知，试验条件下pH3.5～4.5时，花粉的破壁率上升；当pH4.5～5.0时，破壁率下降。显然，pH4.5时，花粉破壁率最高[20]，pH4.5是复合酶破壁的最适pH值。

2.3.2 复合酶加入量对花粉破壁率的影响

图7 复合酶加入量对花粉破壁率的影响Fig.7 Effect of total enzyme dosage on the disruption of lotus bee pollen cell walls

由图7可知，当复合酶加入量在0.4‰～12‰时，破壁率上升得快；而当加酶量为12‰～15‰时，破壁率基本趋于平衡。选择12‰为复合酶的最适加入量。

2.3.3 酶解温度对花粉破壁率的影响

图8 酶解温度对花粉破壁率的影响Fig.8 Effect of hydrolysis temperature on the disruption of lotus bee pollen cell walls

由图8可知，温度对花粉破壁率的作用很显著，呈现先上升后下降的趋势。在45℃时，花粉的破壁率最高。

2.3.4 料水比对花粉破壁率的影响

图9 料水比对花粉破壁率的影响Fig.9 Effect of material-to-water ratio on the disruption of lotus bee pollen cell walls

由图9可知，1:9为最合适的料水比。

2.3.5 酶解时间对花粉破壁率的影响

图10 酶解时间对花粉破壁率的影响Fig.10 Effect of hydrolysis time on the disruption of lotus bee pollen cell walls

由图10可知，当酶解时间6h时，花粉已达到最大破壁率，过长时间对划分的破壁率没有影响。

根据酶解pH值、复合酶加入量、酶解温度、料水比和酶解时间对花粉破壁率的作用，试验选用酶解pH值、复合酶加入量、酶解温度、料水比为研究因素进行正交试验，以得到最佳酶解破壁条件。

2.4 二次回归正交旋转组合设计试验结果及其数学模型分析

依据单因素试验结果，确定因素编码水平范围，采用二次回归正交旋转组合设计，以破壁率为指标，取酶解pH值、复合酶加入量、酶解温度、料水比作为考察因素，共进行23次试验，因素编码见表1。

表1 因素水平编码表Table 1 Variables and their coded levels for quadratic orthogonal rotation combination design

2.4.1 数学模型的建立

表2 二次回归正交旋转组合设计试验方案与结果Table 2 Quadratic orthogonal rotation combination design and corresponding experimental results

续表2

根据表2结果得到如下回归方程：

2.4.2 二次回归模型的显著性检验

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance for the experimental results of quadratic orthogonal rotation combination design

由表3可知，失拟项F1＝ 2.808＜F0.05(2,6)＝10.92，说明失拟不显著。回归方程的显著性检验F2＝646.182＞ F0.01(14,8)＝5.56，说明回归是显著的。由此可认为上面给出的二次回归方程模型是可行的。

2.4.3 重建二次回归模型

根据表3，剔除回归方程中不显著项，得到简化后的回归方程：

各个因素对破壁率效果影响大小顺序为酶解温度(X3)＞酶解pH值(X1)＞复合酶加入量(X2)＞料水比(X4)。破壁率与酶解pH值、复合酶加入量、酶解温度和料水比相关指数R2＝99.91%，表明该数学模型4个因素对产量的影响占99.91%，而其他因素的影响很小。

2.5 酶解破壁工艺优化及验证实验

由简化的回归方程预测可得，最优水平各个因素组合为：当X1的编码水平为－1，X2的编码水平为0，X3的编码水平为0，X4的编码为1.682时，Ymax=89.21。即酶解pH4.0、复合酶加入量12‰、酶解温度45℃、料水比1:14时，莲花蜂花粉破壁率最高为89.21%。选取最优组合水平进行了3次重复，进行验证实验，结果见表4。

表4 验证实验结果Table 4 Validation of optimal hydrolysis conditions

3组重复实验的实际破壁率与根据模型得到的结果误差均小于5%，说明该模型能准确地反映花粉破壁的实际情况。

2.6 理化指标测定

表5 理化指标检测结果Table 5 Physiochemical properties of intact and disrupted lotus bee pollen cells

由表5可知，对花粉破壁前后进行理化比较分析发现，营养物质含量都略微有增加，尤其是粗蛋白含量增加较大。所以，破壁有利于花粉的利用和深加工。

3 结 论

通过对4种酶制剂的单因素试验和二次回归正交旋转组合设计试验方法对酶解破壁条件进行优化。最终确定莲花花粉酶解破壁的最佳条件为酶解pH4.0、复合酶加入量12‰、酶解温度45℃、料水比1:14，此条件下破壁率为89.21%，粗蛋白等营养物质都有所增加。

与其他破壁方法相比，酶解破壁具有专一性、反应条件温和、利于保存花粉中的营养活性物质等优点；并且具有高效，破壁效果好，作用稳定的特点，有利于实现花粉破壁的产业化、标准化生产。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions for Disruption of Lotus Bee Pollen Cell Walls

YANG Wen-chao，CHEN Hu-nan，MIAO Xiao-qing*
(College of Bee Science, Fujian Agricultural and Foresty University, Fuzhou 350002, China)

The purpose of the present study was to develop a method to disrupt lotus bee pollen cell walls by one-step multienzymatic hydrolysis. Preliminary experiments were designed to investigate the effect of hydrolysis with different dosages of cellulase alone, 0.8% celluase and different dosages of pectinase, 0.8% celluase, 0.4% pectinase and different dosages of xylanase, or 0.8% celluase, 0.4% pectinase, 0.2% xylanase and different dosages of papain on the disruption of lotus bee pollen cell walls. We found that a mixture of cellulase, pectinase, xylanase and papain at a ratio of 4:2:1:3 was the best enzyme for the disruption of lotus bee pollen cell walls. Further, four hydrolysis parameters including pH, total enzyme dosage, temperature and material-to-water ratio for disrupting lotus bee pollen cell walls with this mixture of enzymes were optimized employing quadratic orthogonal rotation combination design. A mathematical model describing cell disruption percentage as a function of these four parameters was established. The optimal enzymatic hydrolysis parameters were found as pH 4.0, 12‰ of total enzyme dosage, 45 ℃ of hydrolysis temperature, and 1:14 (g/mL) of material-to-water ratio, resulting in a cell disruption percentage of 89.21%.

lotus bee pollen；enzymes；cell wall disruption

S896.4

A

1002-6630(2012)16-0012-06

2011-07-03

国家现代农业(蜂)产业技术体系项目(CARS-45-KXJ19)

杨文超(1980—)，男，讲师，博士，研究方向为蜂产品加工与应用。E-mail：ywenchao13@163.com

*通信作者：缪晓青(1959—)，男，教授，研究方向为蜂产品加工与应用。E-mail：fjbees@126.com