吴笑臣，王科军，钟金莲，罗序中*

(赣南师范学院生命与环境科学学院，江西 赣州 341000)

响应面法优化脐橙渣中类柠檬苦素的提取工艺

吴笑臣，王科军，钟金莲，罗序中*

(赣南师范学院生命与环境科学学院，江西 赣州 341000)

以赣南脐橙渣为原料、乙醇为溶剂，通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面分析法，建立乙醇体积分数、超声时间、提取温度与类柠檬苦素得率之间的回归方程，对脐橙渣中类柠檬苦素的提取条件进行优化，最佳提取条件为乙醇体积分数82%、超声时间18min、提取温度60℃。此条件下类柠檬苦素得率为1.632‰，与预测值1.651‰较为一致。

脐橙渣；类柠檬苦素；提取；响应面法；优化

研究表明，类柠檬苦素(limonoids)在抗癌[1]、镇痛[2]、抑菌[3]、抗氧化[4]和除虫[5]等方面都具有显著效果，在功能食品、保健品等方面具有广阔的应用前景，其提取工艺和药用功能已成为当今植物药物研究的热点[6-8]。类柠檬苦素是主要由芸香科和楝科植物产生的三萜类次生代谢物质[9-10]，含量不高，需要大量的植物资源才能满足其工业化生产，因此原料供应不足是类柠檬苦素开发面临的首要问题[11]。脐橙是赣南地方经济的重要支柱产业，2010年产量近200万吨。随着赣南脐橙榨汁加工业的快速发展，每年都会产生大量的脐橙渣，这些残渣中含有许多重要的生物活性物质，如类柠檬苦素、黄酮类化合物等[12]。目前国内柑橘加工后的皮渣一般作为饲料、肥料或废弃物处理，经济效益低，且易污染环境[13]。因此充分利用脐橙渣资源，提取其中宝贵的生物活性物质，对提高脐橙产品附加值和保护环境都具有非常重要的意义。本实验利用乙醇溶液为提取剂，超声波辅助提取脐橙渣中类柠檬苦素，并结合Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、响应面法对提取工艺进行优化，从而提高脐橙类柠檬苦素的产率，为赣南脐橙渣资源的研究开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜脐橙榨汁后剩余皮渣 江西省脐橙工程技术研究中心。柠檬苦素标样 美国Sigma公司；石油醚、乙醇、二氯甲烷、硫酸、氯化铁、对-二甲氨基苯甲醛等均为国产分析纯试剂；显色试剂A液：量取65mL浓硫酸和35mL无水乙醇，将其混合，待冷却后加入125mg对-二甲氨基苯甲醛；显色试剂B液：称取9.0g氯化铁，用蒸馏水溶解并定容至100mL，使用时向显色试剂A液中加入0.05mL显色试剂B液并混匀[14]。

1.2 仪器与设备

DZF-6090型真空干燥箱 上海三发科学仪器有限公司；SK7210HP型超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发 上海亚荣生化仪器厂；WFJ 7200型分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备[15]

将脐橙渣干燥后过40目筛，用石油醚回流脱脂24h后备用。准确称取样品5g，加入乙醇溶液冰浴超声。处理后用保鲜膜密封烧杯，水浴浸提。一定时间后抽滤，滤液减压蒸馏得浸膏，用少量二氯甲烷溶解浸膏后抽滤，将滤液旋干，加10mL无水乙醇溶解，得类柠檬苦素提取液。

1.3.2 制作标准曲线和柠檬苦素的定量分析方法

精确称取柠檬苦素标准品9.2mg，用无水乙醇溶解并定容50mL，得质量浓度184mg/L的标准溶液。分别取2mL标样和2mL乙醇溶液于两只10mL试管中，并在每个试管中分别加入5mL显色试剂显色30min后在分光光度计400～600nm波长处进行吸收光谱扫描，得到最大吸收峰为550nm。取6支试管，分别加入0、0.4、0.8、1.2、1.6、2mL上述柠檬苦素标准溶液，加无水乙醇至2mL，按上述方法显色，以柠檬苦素空白液为参比，在550nm波长处测定其吸光度。以吸光度对柠檬苦素的质量浓度作图，得出柠檬苦素的标准曲线。回归方程为y＝0.0024x＋0.0007，r＝0.9994。

精确吸取一定量的样品制备液，按照标准曲线的方法测定样品制备液的吸光度，并通过回归方程计算提取液中柠檬苦素质量浓度。计算脐橙渣中类柠檬苦素得率。

式中：c为提取液中类柠檬苦素的质量浓度/(μg/mL)；V为提取液体积/mL；m为脐橙渣的质量/g。

1.3.3 类柠檬苦素超声提取条件的优化

1.3.3.1 Plackett-Burman(PB)试验设计[16]

根据前期单因素试验和相关文献报道[17]，通过PB试验对影响脐橙类柠檬苦素得率的6个因素即乙醇体积分数、液料比、超声功率、超声时间、提取温度、提取时间和2个虚拟变量进行筛选，找出主要影响因素。每个因素设高(＋)、低(－)两个水平共12个处理，各因素水平设置见表1。

表1 脐橙渣类柠檬苦素提取工艺Plackett-Burman试验优化因素水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in Plackett-Burman design

1.3.3.2 最陡爬坡试验[18]

根据PB试验结果，以拟合的一阶模型回归系数的符号和大小来设计显著因素的最陡爬坡方向及步长，使主要因素同时朝响应值增大的方向变化，进行最陡爬坡试验，找出峰值，从而逼近最大响应区域。

1.3.3.3 Box-Behnken试验设计(Box-Behnken Design，BBD)[19]

以脐橙类柠檬苦素得率为响应值，采用三因素三水平的BBD试验方案对影响脐橙类柠檬苦素的3个主要影响因素进行优化，其中心点取最陡爬坡试验最大响应值时的水平值。然后对实验数据拟合得到二阶响应面模型，确定最优实验条件，并进行验证。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验结果

表2为PB试验各因素的偏回归系数及其显著性分析。结果显示，回归模型的P＝0.0238(P＜0.05)，决定系数R2＝97.57%，说明回归方程拟合很好。由各因素显著性效应可以看出，对脐橙类柠檬苦素提取得率影响显著的是乙醇体积分数、超声时间、提取温度(P＜0.05)，且三者对得率均呈正效应，与文献相一致[11,20]。因此，利用响应面分析法对此三因素之间的相互关系进行更深入的研究。其他因素对类柠檬苦素得率影响不显著，在后续实验中的用量均维持低水平。

表2 偏回归系数及影响因子的显著性分析Table 2 Partial regression coefficients and significance analysis of the fitted regression model based on Plackett-Burman design

2.2 最陡爬坡试验结果

根据乙醇体积分数、超声时间、提取温度三因素效应大小的比例和实际情况，设计其变化方向和步长并进行最陡爬坡试验，结果见表3。由表3可以看出，最优提取条件可能在处理2和处理4之间，故以处理3为响应面试验的中心点。

表3 最陡爬坡试验设计及结果Table 3 Steepest ascent design and results

2.3 响应面优化试验

2.3.1 数学模型的建立与检验

利用Design-Expert软件中BBD试验，得到脐橙类柠檬苦素提取的三因素三水平试验方案及结果见表4。拟合试验数据得到二次回归模型：Y＝－50.0053＋1.042544X1＋0.332452X2＋0.208066X3－0.0028X1X2－0.00034X1X3＋0.000365X2X3－0.006X12－0.00346X22－0.00163X32。

表4 Box-Behnken试验设计及结果Table 4 Box-Behnken design and corresponding experimental results

对二次回归模型进行方差分析，结果见表5。可以看出，该模型效应极显著(P＝0.0005＜0.05)。各因素中一次项X1、二次项X12、X32及交互项X1X2均表现出了显著水平，交互项X1X3、X2X3不显著。回归模型的决定系数为0.9579，修正决定系数为0.9038，即90.38%的数据可用此模型解释，失拟项差异不显著，说明回归方程拟合程度高，可以应用于从脐橙中提取类柠檬苦素的分析预测。

表5 二次多项模型方差分析表Table 5 Analysis of variance for the fitted quadratic model based on Box-Behnken design

2.3.2 响应面及等高线分析

为了考察交互项对类柠檬苦素得率的影响，在其他因素固定不变的情况下，利用Design-Expert 7.1软件对回归方程进行运算，作出交互项的响应曲面图及等高线图，见图1。

图1 各两因素交互作用对类柠檬苦素得率影响的响应面和等高线图Fig.1 Response surface plots showing the pairwise interaction effects of extraction parameters on the extraction yield of limonoids

图1a显示提取温度为60℃时，乙醇体积分数与超声时间对类柠檬苦素得率的影响。首先，在不同的超声时间条件下随着乙醇体积分数的提高，类柠檬苦素得率均呈现先增加后减小的趋势。这可能是由于乙醇具有一定的极性，若体积分数过高则不利于非极性、弱极性类型的类柠檬苦素的溶出从而使提取率下降[21]。其次，类柠檬苦素得率的变化幅度不同，超声时间短的条件下其变化幅度要大于超声时间长的。这是因为脐橙渣在超声空化、乙醇浸泡等多种因素的作用下，类柠檬苦素溶出的速度和总量发生复杂的变化。在超声时间较短时，空化作用弱，类柠檬苦素的溶出主要依赖于乙醇体积分数的升高；随着超声时间增大，空化作用加强，则乙醇体积分数升高产生的效应相对减弱。可见在不同的超声时间条件下，乙醇体积分数的变化对类柠檬苦素得率的影响是不同的，二者交互作用显著，与方差分析结果一致。

图1b表示超声时间为20min时，乙醇体积分数和提取温度的交互作用。图1c表示乙醇体积分数为80%时，超声时间和提取温度的交互作用。类柠檬苦素得率均呈现先增加后减小的趋势，但交互作用不显著。

2.4 验证实验

由Design-Expert 7.1.6软件给出最佳提取条件为：乙醇体积分数81.59%、超声时间18.11min、提取温度58.78℃，其对应的响应值为1.651‰。考虑到实际情况，将最优条件定为乙醇体积分数8 2%、超声时间18min、提取温度60℃，其他因素不变的情况下进行验证实验，重复3次，类柠檬苦素平均得率为1.632‰，与预测值接近，表明该模型能较好地预测脐橙渣中类柠檬苦素的提取情况。

3 结 论

通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验建立乙醇体积分数(X1)、超声时间(X2)、提取温度(X3)与脐橙渣中类柠檬苦素得率之间的回归方程，各因素中乙醇体积分数(X1)、二次项X12、X32及乙醇体积分数与超声时间的交互(X1X2)对类柠檬苦素的提取效果影响显著；得到最佳提取条件为乙醇体积分数82%、超声时间18min、提取温度60℃。在此条件下，类柠檬苦素的得率为1.632‰，与预测值1.651‰基本一致，回归模型可较好地预测脐橙渣中类柠檬苦素的提取情况。

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Optimization of Extraction Process for Limonoids from Navel Orange Residues by Response Surface Methodology

WU Xiao-chen，WANG Ke-jun，ZHONG Jin-lian，LUO Xu-zhong*
(College of Life and Environmental Science, Gannan Normal University, Ganzhou 341000, China)

An ultrasonic-assisted method to extract limonoids from navel orange residues left over from juicing using ethanol as the extraction solvent was proposed and optimized. Ethanol concentration, ultrasonic treatment time and extraction temperature were identified as main parameters that influence limonoids yield using Plackett-Burman design combined with the steepest ascent method. A regression equation reflecting the relationship between limonoids yield and these main affecting parameters was established based on Box-Behnken experimental design to optimize the three extraction parameters using response surface methodology.The optimal ethanol concentration, ultrasonic treatment time and extraction temperature were 82%, 18 min and 60 ℃, respectively.Under these conditions, the actual extraction yield of limonoids was 1.632‰, which was close to the predicted value of 1.651‰.

navel orange residue；limonoids；extraction；response surface methodology；optimization

TS201.2

A

1002-6630(2012)16-0035-05

2011-06-09

江西省科技厅科技支撑计划项目(2010BNB1400)；江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ10587)；江西省教育厅青年科学基金项目(GJJ11214)；赣州市果业基金项目(GZGY2008-1)；赣南师范学院自然科学研究课题(09kyz10)

吴笑臣(1975—)，男，讲师，硕士，研究方向为食品加工技术。E-mail：wuxiaochen1111@126.com

*通信作者：罗序中(1969—)，男，教授，博士，研究方向为食品加工技术及有机小分子凝胶。E-mail：luoxuzhong@yahoo.com.cn