朱 丹，邹水洋，*，康建雄

(1.东莞理工学院化学与环境工程学院，广东东莞 523808;2.华中科技大学环境科学与工程学院，湖北武汉 430074)

纳豆芽孢杆菌液态发酵生产γ－聚谷氨酸

朱 丹1，邹水洋1，*，康建雄2

(1.东莞理工学院化学与环境工程学院，广东东莞 523808;2.华中科技大学环境科学与工程学院，湖北武汉 430074)

对纳豆芽孢杆菌CICC 20643液态发酵生产γ－聚谷氨酸(γ－PGA)的工艺进行了研究。采用单因素实验和正交实验获得了生产γ－PGA的优化培养条件:蔗糖25g/L，酵母膏5g/L，谷氨酸钠40g/L，装液量70mL/250mL锥形瓶，起始pH6.5，菌种在37℃、120r/min培养24h后，于培养基中添加5%NaCl，继续培养24h，γ－PGA的产量达到18.04g/L。实验结果表明:纳豆芽孢杆菌CICC 20643是一株产γ－PGA优良菌种，在发酵过程中添加NaCl的工艺能明显提高γ－PGA的产量。

纳豆芽孢杆菌，γ－聚谷氨酸，液态发酵，氯化钠，谷氨酸

γ－聚谷氨酸(poly γ－glutamic acid，γ－PGA)是由L－谷氨酸或D－谷氨酸通过γ－酰胺键结合形成的一种水溶性的生物高分子材料。由于γ－PGA具有吸水性、可降解性、水解性等众多特性，因此被广泛用于医药、食品加工、农业、绿化以及水处理等多种领域，具有极大的开发价值和应用前景［1－3］。γ－聚谷氨酸最初发现是作为炭疽芽孢杆菌荚膜的一种主要成分而存在，后来人们陆续发现多种芽孢杆菌都能在胞外产生 γ－PGA［4］。由于枯草(纳豆)芽孢杆菌(Bacillus subtilis)［5－6］、地 衣 芽 孢 杆 菌 (Bacillus Licheniformis)［7－8］的易培育性和安全性，现在聚谷氨酸的生产大多报道由此类菌株产生。尽管许多研究者对微生物发酵法生产γ－PGA进行了大量研究，但产率普遍处于较低水平，生产成本高，这在很大程度上限制了γ－PGA的工业生产与应用。由于γ－PGA生物合成的机理至今尚不很清楚，而且菌株生成γ－PGA的代谢途径复杂，调节方式多样，目前提高其生产效率的方法主要依靠选育优良菌种和优化发酵工艺。本文拟对一株产 γ－PGA的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)的液态发酵工艺进行研究，为其工业生产与应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

纳豆芽孢杆菌(B.subtilis natto)CICC 20643 中国工业微生物菌种保藏中心(CICC);豆芽汁 市售大豆芽0.5kg，加水2.5kg，煮沸，浓缩至1000mL，过滤待用;斜面培养基 豆芽汁 100mL，蔗糖5g，琼脂1.5～2.0g，自然pH;种子培养基 蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0;基础发酵培养基 蛋白胨10g/L，葡萄糖25g/L，谷氨酸钠30g/L，Na2HPO41g/L，NaH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，pH7.0;以上试剂均为国产分析纯或生化试剂。

LDZX－40KB立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;HQL300B柜式恒温冷冻摇床 武汉中科科仪公司;Spectrumlap20可见光分光光度计 上海凌光技术有限公司;SPX－250型生化培养箱 上海跃进医疗器械厂;TDL－5－A多管离心机 上海安亭科学仪器厂;LDZX－40KB立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂;FA2104电子天平 上海恒平科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验

1.2.1.1 菌种培养 菌种在斜面培养基上30℃培养2d，冷藏备用。种子液培养:取一环斜面菌种接种于种子培养基中(250mL锥形瓶装液量50mL)，在恒温摇床上37℃、120r/min培养24h。

1.2.1.2 γ－PGA的生产 250mL锥形瓶装入50mL发酵培养基，按2%接种量接入种子液，37℃、120r/min摇瓶培养48h，测定培养物的生物量和γ－PGA产量。在考察碳源、氮源的影响时，仅改变基础发酵培养基中碳源、氮源种类，即分别以25g/L葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、柠檬酸、甘油做碳源，以10g/L酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、草酸铵做氮源进行液态发酵。在考察谷氨酸钠浓度、装液量、起始pH对发酵的影响时，仅就该因素的水平做相应变化，其他组成参照基础发酵培养基。发酵过程中添加NaCl的方法:将菌种前培养0～36h后在培养基中添加5%NaCl(固体颗粒经灭菌后按无菌操作方式加入)，继续培养至48h。以上实验均平行做3个样品，实验结果取其平均值，标准偏差小于5%。

1.2.2 正交实验 以蔗糖、酵母膏、谷氨酸钠和装液量作为考察对象，设计了4因素3水平正交实验方案，影响因素、水平见表1所示。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiments

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 生物量的测定 将发酵液稀释25倍后用可见分光光度计测定660nm下的吸光值A660［9］。

1.2.3.2 γ－PGA产量的测定 将发酵液于5000r/min下离心25min，上清液用1mol/L盐酸调pH到3.0，加入4倍体积的95%乙醇，放于4℃下冰箱内过夜。然后于5000r/min下离心20min，用乙醇洗涤、收集粘性沉淀物，干燥得粗品称重。

2 结果与讨论

2.1 碳源对γ－PGA产量及生物量的影响

考察了多种碳源对γ－PGA产量和生物量的影响，结果如表2所示。常用的一些糖类碳源的表现均比柠檬酸和甘油要好，其中以蔗糖作碳源时的生物量与γ－PGA产量都最高，因此选择蔗糖作为碳源。有文献报道以柠檬酸和甘油作为碳源能促进地衣芽孢杆菌 γ－PGA 的合成［7－8］，但对于本实验菌种来说，以柠檬酸和甘油为碳源时生物量和γ－PGA产量均很低，这可能是菌种不同的原因。

表2 不同碳源对γ－PGA产量及生物量的影响Table 2 Effects of various carbon sources on yield of γ－PGA and biomass

2.2 氮源对γ－PGA产量及生物量的影响

考察了多种有机氮源和无机氮源对γ－PGA产量和生物量的影响，实验结果(如表3所示)表明，无机氮源无论是对于菌体的生长还是γ－PGA产量效果都比较差。有机氮源效果相对较好，其中以添加酵母膏的培养物中γ－PGA产量最大，因此选择酵母膏为氮源。

表3 不同氮源对γ－PGA产量及生物量的影响Table 3 Effects of various nitrogen sources on yield of γ－PGA and biomass

2.3 谷氨酸钠浓度对γ－PGA产量及生物量的影响

L－谷氨酸对微生物合成γ－PGA的影响较复杂，因菌种不同而异。根据细胞生长的营养要求是否需要L－谷氨酸，可以把γ－PGA产生菌分为两大类:一类是培养时需要L－谷氨酸才能积累γ－PGA，称之为谷氨酸依赖型菌种;另一类是培养时不需要L－谷氨酸也能积累γ－PGA，称之为非谷氨酸依赖型菌种［1］。从本实验结果来看(如图1所示)，当培养基中未添加谷氨酸钠时，只有微量的γ－PG产生，说明本研究选用的B.subtilis natto为谷氨酸依赖型γ－PGA产生菌，谷氨酸作为γ－PGA合成的前体物质对γ－PGA的产量有很大影响。在谷氨酸钠浓度为20～30g/L时，γ－PGA的产量较高。

2.4 装液量对γ－PGA产量及生物量的影响

在250mL 锥形瓶内分别装入 30、40、50、60、70、80mL培养基，在摇床转速为120r/min的条件下发酵，以考察装液量对γ－PGA合成的影响，结果如图2所示。当摇床转速一定时，装液量与溶解氧高低呈反相关。适度的溶解氧有利于菌体的生长与γ－PGA的合成。从本实验结果来看，取装液量为50～70mL/250mL锥形瓶比较适宜。

2.5 起始pH对γ－PGA产量及生物量的影响

图1 谷氨酸钠浓度对γ－PGA合成及生物量的影响Fig.1 Effect of sodium glutamate concentration on yield of γ－PGA and biomass

图2 装液量对γ－PGA合成及生物量的影响Fig.2 Effect of loading amount on yield of γ－PGA and biomass

调节培养基灭菌前起始pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，以考察起始 pH 对发酵的影响。如图3所示，不同的pH对菌体生长和γ－PGA产量都有一定影响。当起始pH小于6.0时，菌体生长和γ－PGA合成均受到较明显地抑制;在pH6.0～7.0时，菌体生长很好，γ－PGA产量也高，其中以起始pH在6.5时，γ－PGA产量最高。以下实验中均采用培养基起始pH6.5。γ－PGA产量影响很大。随着前培养时间的延长，生物量和 γ－PGA产量不断增大，在24h达到峰值，γ－PGA产量为15.01g/L，与未添加NaCl的情况相比产量约提高30%。γ－PGA作为某些芽孢杆菌的荚膜或黏液层的主要有机成分，其产量与菌种的遗传属性、生物量以及所处环境条件密切相关。根据B.subtilis natto CICC 20643的生长曲线，菌种大致在培养18～24h后进入稳定期(数据未列出)，因此将菌种在不受抑制的状态下培养，待其进入生长稳定期后加入NaCl再继续培养，则既保证了足够的生物量，又形成了合成 γ－PGA的有利环境(较高渗透压)，使γ－PGA产量提高。因此以下实验均采用将菌种前培养24h后添加5%NaCl再继续培养24h的发酵工艺。

图4 不同前培养时间下添加NaCl对γ－PGA合成及生物量的影响Fig.4 Effect of added NaCl in different pre－cultivation time on yield of γ－PGA and biomass

表4 正交实验结果Table 4 Results of the orthogonal experiments

图3 起始pH对γ－PGA合成及生物量的影响Fig.3 Effect of initial pH on yield of γ－PGA and biomass

2.6 发酵过程中添加NaCl对γ－PGA产量及生物量的影响

有文献［6］报道在配制培养基时添加NaCl培养枯草芽孢杆菌能提高γ－PGA的产量，并认为这是菌种对渗透压提高的一种适应机制。但我们的研究发现这种添加NaCl的方式使B.subtilis natto CICC 20643的生物量和γ－PGA产量都很低，究其原因是配制培养基时添加大量NaCl会形成较高的渗透压，这对菌体的生长会造成很大程度的抑制。于是改变NaCl的添加方式，考察在发酵过程中(即将菌种前培养一定时间后)添加5%NaCl对发酵结果的影响。实验结果如图4所示，添加 NaCl的时机对生物量和

2.7 正交实验对培养条件的优化

以上单因素实验确定了碳源、氮源种类以及谷氨酸钠用量和装液量的大致范围。利用发酵培养基中主要组分进行正交实验是培养条件优化的常用办法，因此以蔗糖、酵母膏、谷氨酸钠和装液量作为考察对象，进行了4因素3水平正交实验来优化培养条件，正交实验结果见表4所示。

通过极差分析结果可以看出，对γ－PGA合成的影响因子排序是谷氨酸钠＞蔗糖＞装液量＞酵母膏。正交实验结果分析得到优化的培养条件为:蔗糖25g/L，酵母膏 5g/L，谷氨酸钠 40g/L，装液量70mL/250mL锥形瓶。在上述优化条件下验证培养，γ－PGA平均产量为18.04g/L，达到了文献报道的较高水平［1］，且优于正交表中γ－PGA最高产量的7号方案，因此确定该方案为最终优化方案。

3 结论

液态发酵过程中添加NaCl的工艺能明显提高B.subtilis natto CICC 20643合成γ－PGA的产量。优化后的发酵培养基组成为:蔗糖25g/L，酵母膏5g/L，谷氨 酸 钠 40g/L，Na2HPO41g/L，NaH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，装液量70mL/250mL锥形瓶，初始pH为6.5，菌种在37℃、120r/min培养24h后添加5%NaCl，再继续培养 24h，γ－PGA的产量可达到18.04g/L。

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Production of poly－γ－glutamic acid by submerged fermentation with Bacillus subtilis natto

ZHU Dan1，ZOU Shui－yang1，*，KANG Jian－xiong2
(1.School of Chemistry and Environmental Engineering，Dongguan University of Technology，Dongguan 523808，China;2.School of Environmental Science and Engineering，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China)

Production of poly－γ－glutamic acid(γ－PGA)by cultivation of Bacillus subtilis natto CICC 20643 in submerged state had been studied.The optimum cultivation conditions through single factor and orthogonal experiments were set as follows:sucrose 25g/L，yeast extract 5g/L，glutamic acid 40g/L，initial pH at 6.5，culture volume 70mL in 250mL conical flask.Under the optimum cultivation conditions，B.subtilis natto was shaking cultivated at 37℃，120r/min for 24h，then 5%NaCl was added，and subsequently cultivated for another 24h.As a result，the yield of γ－PGA was got at 18.04g/L.The experimental result showed that B.subtilis natto CICC 20643 was a strain of high－yield γ－PGA and addition of NaCl in the course of cultivation could increase the yield of γ－PGA.

Bacillus subtilis natto;γ－PGA;submerged fermentation;NaCl;glutamic acid

TS201.3

A

1002－0306(2012)17－0151－04

2012－02－01 *通讯联系人

朱丹(1980－)，女，硕士，讲师，主要从事微生物发酵的研究。

东莞市高等院校科研机构科技计划项目(200910814046)。