姚晓蕾，王玉田，孟 鑫

(辽宁医学院食品科学与工程学院，辽宁锦州 121001)

猪肉内源性脂肪酶三种提取方法的比较研究

姚晓蕾，王玉田*，孟 鑫

(辽宁医学院食品科学与工程学院，辽宁锦州 121001)

比较PEG2000/(NH4)2SO4双水相体系萃取法、反胶团提取法、双水相萃取和壳聚糖沉淀相结合的三种方法对猪肉内源性脂肪酶萃取效果的影响。通过正交实验进一步优化每一种方法的提取条件。结果表明:在PEG2000浓度25%、(NH4)2SO4浓度12%、pH6.5、壳聚糖浓度为2.5mg/mL的条件下，进行双水相萃取和壳聚糖沉淀相结合法萃取脂肪酶的萃取效果最佳，其萃取率为97.83%，分配系数为5.209，纯化倍数为7.74倍。

双水相，反胶团，壳聚糖沉淀，内源性脂肪酶

脂肪酶全称为三酰甘油酯水解酶，广泛存在于动植物和微生物体中，是一种重要的工业酶制剂。近年来，脂肪酶已被广泛用于食品、洗涤、有机合成、皮革和造纸等行业［1－2］。其中内源性脂肪酶(即肉品自身存在的酶)以它独特的优势，显示出广阔的开发前景［3］。Jin等研究证实了内源性脂肪酶在干腌培根肉的腌制和风干阶段酶活性最高，对改善培根肉的风味起到重要的作用［4］。但是，传统的提取内源性脂肪酶的方法存在生产周期长、工艺参数不确定、所得脂肪酶活力低且不稳定等问题。因此如何高效地提取内源性脂肪酶已受到人们的普遍关注。双水相萃取法、双水相萃取和壳聚糖沉淀相结合法和反胶团提取法都是近些年来发展起来的萃取技术。由于这些提取方法均可以保护蛋白质，使之不易变性，易于工业化连续生产，因而常用于酶的纯化。双水相萃取法具有含水量高、分相时间短、易于工程放大且能保护酶活等优点，已被广泛作为一种分离生物活性物质的方法［5］。壳聚糖作为一种絮凝沉淀剂沉淀目标蛋白质的效率高、用量少且安全无毒，为壳聚糖沉淀法的工业化应用奠定了基础［6］。反胶团是溶解在有机溶剂中的表面活性剂自发形成的纳米级胶体。由于水和表面活性剂在蛋白质表面形成一层“水壳”，使蛋白质避免与有机溶剂直接接触而得到有效的保护［7］。本文分别采用三种方法提取猪肉内源性脂肪酶，该酶是动物体内一种重要的代谢酶，分子量一般为20～60ku之间，等电点一般在4.8～5.0之间，并通过正交实验对三种提取方法进行比较探索，优化提取条件，为猪肉内源性脂肪酶的工业化利用建立一条快速、高效率、高活性的脂肪酶提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

聚乙二醇2000(PEG2000)、硫酸铵(NH4)2SO4、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、壳聚糖 国药集团化学试剂公司，均为分析纯;牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G250 Sigma公司，均为生化试剂;冷鲜猪肉肥肉(当地超市购买即可)。

低速离心机 上海市离心机械研究所;恒温水浴锅 天津泰斯特仪器公司;组织捣碎机 南京昕航科学仪器有限公司;电子分析天平 兰州中西仪器有限公司;紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;pH－3B型精密 pH计 上海雷磁仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 猪肉内源性脂肪酶粗酶液的制备 将新鲜的冷却肉用预冷4℃的蒸馏水冲洗，再用滤纸吸干，称重5.00g，剪碎置于三角瓶中，按其重量加入10倍体积的预冷蒸馏水中，用电动匀浆机匀浆2min，再用离心机以4000r/min的速度离心20min，上清液即为粗酶液，放于4℃冰箱内保存备用。

1.2.2 脂肪酶活性测定方法 采用铜皂法测酶活［8－9］。脂肪酶活力单位定义为:在一定条件下，水解脂肪每分钟产生1μmol的脂肪酸，以U/mL表示。

1.2.3 蛋白质含量的测定方法 参照考马斯亮蓝G－250 法［10］测定蛋白质含量。

1.2.4 双水相萃取法及其正交实验设计 本文采用PEG2000/硫酸铵双水相萃取体系［11］，在常温下按质量配制。酶液量为2g，称取一定量PEG2000和硫酸铵，不足部分以水补充，使体系总质量为10g，静置15min分相。读出上、下相体积，分别测定上下相酶活力和总蛋白含量。有关计算公式为:

式中:X为脂肪酶活力，U·mL－1;c为脂肪酸浓度μmol·mL－1;V为脂肪酸溶液的体积，mL;V'为酶液的用量，mL;t为作用时间，min。

相比R=上相体积/下相体积;

分配系数K=上相酶活/下相酶活;

萃取率C=RK/(1+RK);

比酶活=酶活/蛋白含量;

纯化倍数=上相比酶活/原酶比酶活。

参照单因素实验的结果，选取影响内源性脂肪酶萃取率的PEG2000、(NH4)2SO4、pH这3个影响因素，各取有意义的3个水平，进行3因素3水平L9(34)正交实验，以确定最佳的提取条件。见表1所示。

表1 双水相萃取法的正交实验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test by method of aqueous two－phase extraction

1.2.5 双水相萃取和壳聚糖沉淀相结合法［12］及其正交实验设计 此法利用壳聚糖具有多孔结构，能与大分子物质固定的特性。由于其分子中的羟基和氨基可形成活泼界面，对蛋白质有显著的亲合力，通过离子键、氢键及范德华力而与载体结合，从而将酶吸附。

取上述双水相体系的上相，用浓度为2%的醋酸溶液溶解壳聚糖，加入一定量的壳聚糖醋酸溶液，混合后调pH至定值，并适当搅拌30min，5000r/min离心20min，弃去上清液，得到壳聚糖－脂肪酶复合物，复合物溶于4mL且pH3.8的醋酸盐缓冲液中，剧烈搅拌 30min，使壳聚糖－脂肪酶复合物解离，5000r/min离心20min，进一步去除体系中的少量的仍与脂肪酶结合的壳聚糖和体系中的盐类及杂质，上清液即为脂肪酶溶液。其他同双水相萃取法。

参照单因素实验的结果，选取影响内源性脂肪酶萃取率的 PEG2000、(NH4)2SO4、壳聚糖、pH这4个影响因素，各取有意义的3个水平，进行4因素3水平L9(34)正交实验，以确定最佳的提取条件。见表2所示。

表2 双水相萃取和壳聚糖沉淀相结合法的正交实验因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test by method of aqueous two－phase extraction and chitosan precipitation

1.2.6 反胶团提取法及其正交实验设计 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)是常用的阳离子表面活性剂，在反胶团萃取中，该物质既能溶解蛋白质又能与水分层，同时不破坏蛋白质的生物学活性。此法中的有机溶剂为异辛烷，助溶剂为正己醇。

取相同体积的脂肪酶溶液和CTAB/异辛烷溶液于恒温反应器中，20℃下磁力搅拌 10min后于3000r/min下离心10min，静置分层。有机相用于反提取，水相测酶活和蛋白质含量，取等体积的反提液和含酶有机相于20℃下磁力搅拌15min，3000r/min下离心5min，静置分相，测定水相与有机相中酶活性及通过280nm的吸光度来测定总蛋白质含量。计算公式:

相比R=水相体积/有机相体积;

分配系数M=平衡时水相脂肪酶浓度/平衡时有机相脂肪酶浓度;

萃取率C=RM/(1+RM)。

参照单因素实验的结果，选取影响内源性脂肪酶萃取率的CTAB浓度、相体积比、温度、pH这4个影响因素，各取有意义的3个水平，进行4因素3水平L9(34)正交实验，以确定最佳的提取条件。见表3所示。

表3 反胶团提取法的正交实验因素水平Table 3 Factors and levels of orthogonal test by method of reverse micelles extraction

2 结果与讨论

2.1 双水相萃取法提取脂肪酶的正交实验结果

正交实验结果见表4。

表4 双水相萃取法的正交实验结果Table 4 Result of orthogonal experiment by method of aqueous two－phase extraction

根据表4中极差R值的大小可知，因子的显著性顺序为:PEG2000＞(NH4)2SO4＞pH，根据均差k值大小可知，各因子的最优组合为 A2B2C2，即PEG2000浓度为25%，(NH4)2SO4浓度为12%，pH为6.5，在此最优萃取条件下，采用双水相萃取法萃取猪肉内源性脂肪酶的萃取率为94.28%。

2.2 双水相萃取和壳聚糖沉淀相结合法萃取脂肪酶的正交实验结果

正交实验结果见表5。

表5 双水相萃取和壳聚糖沉淀相结合法的正交实验结果Table 5 Result of orthogonal experiment by aqueous two－phase extraction and chitosan precipitation

根据表5中极差R值的大小可知，因子的显著性顺序为:PEG2000＞(NH4)2SO4＞pH＞壳聚糖，根据均差 k值大小可知，各因子的最优组合为A2B2D2C2，即 PEG2000 浓度25%，(NH4)2SO4浓度为12%，pH为6.5，壳聚糖浓度为2.5mg/mL，在此条件下采用双水相萃取和壳聚糖沉淀相结合法萃取猪肉内源性脂肪酶，萃取率为97.83%。

2.3 反胶团法提取脂肪酶的正交实验结果

正交实验结果见表6。

表6 反胶团提取法的正交实验结果Table 6 Result of orthogonal experiment by reverse micelles extraction

根据表6中极差R值的大小可知，因子的显著性顺序为:CTAB＞pH＞相体积比＞温度，根据均差k值大小可知，各因子的最优组合为 A2C2B1D3，即CTAB 浓度为150mmol/L，pH 为6.5，相体积比为1∶2，温度为40℃，在此最优萃取条件下，采用反胶团提取法萃取猪肉内源性脂肪酶的萃取率为91.71%。

2.4 对三种不同的萃取方法进行分配系数和纯化倍数的比较

为了比较三种不同方法的萃取效果，按照综上三组经正交实验分析所得的最佳萃取条件组合，提取猪肉内源性脂肪酶，并对提取出的脂肪酶进行分配系数和纯化倍数的比较，萃取效果见表7所示。

表7 三种方法对猪肉内源性脂肪酶的萃取效果Table 7 Three ways on the extraction efficiency of the pork endogenous lipase

由表7可知，采用双水相萃取和壳聚糖沉淀相结合的方法提取猪肉内源性脂肪酶，萃取效果最显著，得到的分配系数和纯化倍数最高，分配系数为5.208，纯化倍数为7.74倍;采用双水相萃取法萃取猪肉内源性脂肪酶，萃取效果居中，分配系数为3.902，纯化倍数为3.58倍;采用反胶团提取法提取猪肉内源性脂肪酶，萃取效果相对偏低，是由于反胶团提取会造成脂肪酶的比活力有一定程度的降低，使其分配系数和纯化倍数相对偏低，分配系数为2.613，纯化倍数为1.57倍。

3 结论

通过正交实验对猪肉内源性脂肪酶的三种提取方法进行了优化分析，结果表明:采用双水相萃取和壳聚糖沉淀相结合法可以使脂肪酶的萃取率、分配系数和纯化倍数显著提高，即在PEG2000浓度为25%，(NH4)2SO4浓度为12%，pH6.5，壳聚糖浓度为2.5mg/mL的条件下采用双水相萃取和壳聚糖沉淀相结合法，脂肪酶的萃取率为97.83%，分配系数为5.208，纯化倍数为7.74。本研究为猪肉内源性脂肪酶的工业化利用建立了一条快速、高效率、高活性的提取方法，为工业规模化提取脂肪酶奠定了理论基础。

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Comparison of three extraction methods for pork endogenous lipase

YAO Xiao－lei，WANG Yu－tian*，MENG Xin
(Food Science and Engineering College，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China)

The comparison of extraction of pork endogenous lipase with three methods of PEG2000/(NH4)2SO4aqueous two－phase system extraction and reverse micelles extraction and combination of aqueous two－phase extraction and chitosan precipitation in this paper.Further the extraction conditions for each method were optimized by the orthogonal experiment.The optimized condition was gained:mass fraction of PEG2000 25%，mass fraction of(NH4)2SO412%，pH6.5，Chitosan concentration of 2.5mg/mL.Under the condition of aqueous two phaseextraction and chitosan precipitation phase combination，lipase extraction rate was 97.83%，the maximum distribution coefficient 5.209，multiple purification was 7.74.

aqueous two－phase system;reverse micelles;chitosan precipitation;endogenous lipase

TS251.5+1

B

1002－0306(2012)17－0273－04

2012－02－15 *通讯联系人

姚晓蕾(1986－)，女，硕士研究生，研究方向:肉制品加工与质量控制。

辽宁省科学技术计划项目(2010402004)。