陶昕晨，黄 和，*，李志清，高 平，廖建萌，黄国方，罗 林，陈 宏

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524025；

2.广东省湛江市质量计量监督检测所，广东湛江 524043)

水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的HPLC-UVD法测定

陶昕晨1，黄 和1，*，李志清2，高 平2，廖建萌2，黄国方2，罗 林2，陈 宏2

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524025；

2.广东省湛江市质量计量监督检测所，广东湛江 524043)

建立同时检测水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的HPLC－UVD法。以2%碱性乙酸乙酯作为提取溶剂，正己烷脱脂后直接经高效液相色谱进行分析。氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考在0.10～10.00mg/L范围内有良好的线性关系。在添加浓度为0.25～5.00mg/kg时，平均回收率在81.00%～102.93%之间，RSD在1.95%～7.10%之间。氯霉素的检出限为0.01mg/kg，甲砜霉素和氟苯尼考的检出限为0.02mg/kg。

高效液相色谱，氯霉素，甲砜霉素，氟苯尼考，水产品，残留

氯霉素类（Chloramphenicols，简称CAPs）属酰胺醇类（Amphemicols）广谱抗生素。包括氯霉素及其衍生物，主要有氯霉素（Chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（Thiamphnicol，TAP）和氟苯尼考（Florfenicol，FF）。氯霉素有很强的毒副作用，能够导致再生障碍性贫血症，不可逆，且与使用剂量和频率无关，美国、欧盟、日本等很多国家都禁止在动物源性食品中检出。中国在2002年也把它列为违禁药物，禁止在动物食品中检出。甲砜霉素对血液系统的毒性比氯霉素小，但可以抑制人体免疫系统、红细胞和血小板的生成，除中国和日本外，欧共体和美国均禁用于食品动物。我国农业部规定其在牛、猪和鱼等可食用组织中最高残留限量为50μg/kg[1]。氟苯尼考虽不会引起再生障碍性贫血症，但对动物胚胎有影响。我国农业部规定其在可食性动物组织中最高残留限量为1000μg/kg[1]。氯霉素类药物由于有良好的抗菌和药理特性，特别是甲砜霉素和氟苯尼考不易产生耐药性，与同类药物之间不存在交叉耐药性，很多对氯霉素产生耐药性的菌株对这两种药物仍然敏感，现已成为水产养殖病害防治的常用药物。目前检测氯霉素类药物残留的方法有气相色谱法[2－6]及气相色谱－串联质谱法[7－8]、高效液相色谱法[9－11]及液相色谱－串联质谱法[12－14]、超高效液相色谱法[15]及超高效液相色谱－串联质谱法[16－17]等。这些方法前处理比较复杂，耗时长，成本高。且甲砜霉素与氟苯尼考均为常用药，样品基体中可检出的含量较高，而色谱－质谱联用法同时检测这类化合物的检测限一般在1μg/kg以下，在定量时常需进行大比例稀释。所以液相色谱法更适合于检测。本研究采用2%碱性乙酸乙酯提取，正己烷脱脂，高效液相色谱－双通道紫外检测法同时测定水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，相关方法未见报道，该方法检出限与报道的液相色谱紫外检测法的检出限相比要低，且峰型较好，抗干扰性强，可操作性强，回收率和精确度好，满足甲砜霉素和氟苯尼考残留限量的检测要求，同时也适合对氯霉素的残留进行检测，因此可以在日常检测中应用。

图1 氯霉素类药物结构式Fig.1 Chemical structures of CAPs

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

氯霉素（CSA号：56－75－7） 纯度为99%；甲砜霉素（CSA号：15318－45－3） 纯度为98.5%；氟苯尼考（CSA号：7321－34－2） 纯度为99%；标准品 购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；HPLC级乙腈 购自德国Merck公司；乙酸乙酯、正己烷等 均为分析纯；水为去离子水；对虾、罗非鱼 均由湛江国联水产开发股份有限公司提供。

高效液相色谱仪（Waters Alliance2695/2489） 美国Waters公司；METTLER－TOLEDO XS－205电子分析天平 上海兰易科学仪器有限公司；Sartorius arium－611VF超纯水机 上海摩速科学器材有限公司；BP252组织捣碎机 北京中科科尔器材有限公司；XW－80A漩涡混匀器、HU3120B超声波清洗器 上海比朗仪器有限公司；Sigma 3－18K高速冷冻离心机 北京博劢行仪器有限公司；美国N－EVAP111氮吹仪 美国Organomation公司。

1.2 标准溶液配制

分别准确称取0.010g（精确至0.0001g）氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考标准品，用乙腈分别溶解定容到100mL棕色容量瓶中，配制成100μg/mL标准储备液，4℃冰箱保存，有效期3个月。使用时用流动相逐级稀释储备液成一系列浓度的工作液。

1.3 样品预处理

对虾去头、去壳、去附肢，取肌肉部分；罗非鱼去鳞、去皮，取背部和腹部肌肉。用高速捣碎机将样品捣碎后置于－18℃以下保存。实验时将样品自然解冻至室温。

1.4 样品提取与净化

称取2.0g（精确到0.01g）样品于50mL离心管中，加10mL含2%的浓氨水、25%～28%乙酸乙酯，漩涡混匀1min，再加入5g的无水硫酸钠，振荡提取30min后，4000r/min离心10min，重复上述操作1次，合并上清液，50℃下氮吹近干，再加入2mL流动相溶解残渣，漩涡混匀1min，加入5mL乙腈饱和的正己烷，漩涡混匀1min，4000r/min离心10min，弃去上层正己烷溶液，重复脱脂1次，取下层溶液过0.45μm的有机系滤膜上机测定。

1.5 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18反相色谱柱（250mm× 4.6mm i.d.，5μm）；流速：1mL/min；柱温：35℃；进样体积：10μL；氯霉素检测波长278nm，甲砜霉素和氟苯尼考检测波长225nm；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 The gradient elution program

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

将稀释好的10μg/mL氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考标准液在波长190～370nm范围进行紫外扫描，发现氯霉素在278nm、甲砜霉素和氟苯尼考在224nm处有最大吸收，故选择氯霉素检测波长为278nm，甲砜霉素和氟苯尼考检测波长为224nm。

2.2 流动相的优化

氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考都属于极性物质，一般选用甲醇－水或乙腈－水作流动相[18]。本实验比较了这两种流动相的效果，发现甲醇－水作流动相时，其保留时间比较短，容易被杂质峰干扰。等度洗脱时，调高乙腈比例（30%～40%），甲砜霉素保留时间太短，容易受干扰；调低乙腈比例（15%～20%）时，虽然延长了保留时间，但其峰型都变宽，导致检出限升高，所以选用梯度洗脱。经过大量样品测定，梯度洗脱时受到的干扰很少。结果如图2所示。

图2 氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考标准溶液色谱图（10.00mg/L）Fig.2 Chromatogram of CAP，TAP and FF standard solution（10.00mg/L）

2.3 提取溶剂的选择

常用丙酮、乙腈和乙酸乙酯等作为氯霉素类药物的提取溶剂[18]。本实验比较了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、2%碱性乙酸乙酯、乙酸乙酯－乙腈（1∶1）和2%碱性乙酸乙酯－乙腈（1∶1）对空白对虾中3种氯霉素类药物的提取效果，2%碱性乙酸乙酯和2%碱性乙酸乙酯－乙腈（1∶1）对3种氯霉素类药物的提取效果相当，但加入的乙腈使得在浓缩的过程中变慢，还增加了提取成本，所以选择2%碱性乙酸乙酯作为最佳提取溶剂。通过大量实验样品分析，该提取液对3种氯霉素类药物的回收率较高，样品液澄清，色谱的分离效果好。

2.4 方法的线性范围和检出限

在本方法所确定的实验条件下，以峰面积（y）为纵坐标，标准液浓度（x，μg/mL）为横坐标作图，获得氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的线性方程、相关系数、线性范围见表2。通过添加不断稀释的标准品到空白样品，前处理方法同1.4，以信噪比（S/N）为3作为检出限，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的检出限分别为：0.01、0.02、0.02mg/kg。

表2 回归方程与相关系数、线性范围和检出限Table 2 The regression equations，correlation coefficient，linear range and detection limits

2.5 方法回收率和精密度

在空白对虾和罗非鱼的肌肉样品中，分别添加0.25、0.50、5.00mg/kg，3个浓度水平的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考标准品，每个浓度水平做5个平行实验，计算这3种药物的加标回收率和相对标准偏差（RSD）。结果表明，三种药物在0.25、0.50和5.00mg/kg添加水平下平均回收率在81.00%～102.93%之间，RSD在1.95%～7.10%之间。说明本方法可以满足水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的检测要求。方法回收率和相对标准偏差见表3。

图3 对虾空白样品色谱图Fig.3 Chromatogram of Shrimp blank sample

图3表明，经过前处理的空白对虾样品在目标峰处没有杂质峰的干扰，且杂质少，说明这种提取方法能够有效的去除杂质的干扰。

图4 对虾加标样品图（5.00mg/kg）Fig.4 Chromatogram of Shrimp spiked sample（5.00mg/kg）

图4表明三种氯霉素类药物峰型和分离度较好，且无杂质峰的干扰，说明选择的检测条件能够很好的检测对虾中氯霉素类药物的残留。

图5 罗非鱼空白样品图Fig.5 Chromatogram of Tilapia blank sample

图5表明此方法对空白罗非鱼的提取与净化使杂质在2～4min被洗脱，能够排除杂质干扰，说明此方法能够很好的去除罗非鱼中杂质对这三种氯霉素类药物检测的干扰。

图6 罗非鱼加标样品图（5.00mg/kg）Fig.6 Chromatogram of Tilapia spiked sample（5.00mg/kg）

表3 氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的加标回收率和相对标准偏差Table 3 Recovery and RSD of CAP，TAP and FF

图6表明三种氯霉素类药物峰型和分离度较好，且能够有效去除杂质干扰，说明这种方法能够有效的提取和检测罗非鱼中氯霉素类药物。

3 结论

建立了一种以梯度洗脱方式，双波长同时检测水产品中3种氯霉素类药物残留的HPLC－UVD法。以2%碱性乙酸乙酯为提取溶剂，超声波提取，正己烷脱脂，带紫外检测器的高效液相色谱仪检测。此方法前处理简单、快捷，容易形成标准化操作，精密度高，重现性好，定性准确，满足甲砜霉素和氟苯尼考残留限量的检测要求，同时也可以对氯霉素的残留进行检测，适合于大量水产品中氯霉素类药物残留的快速检测和监控。

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Determination of residues of chloramphenicol，thiamphnicol and florfenicol in fishery products by HPLC-UVD

TAO Xin-chen1，HUANG He1，*，LI Zhi-qing2，GAO Ping2，LIAO Jian-meng2，HUANG Guo-fang2，LUO Lin2，CHEN Hong2
（1.Institute of Food Science and Technology of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China；
2.Zhanjiang Institute of Supervision＆Test on Quality＆Measure，Zhanjiang 524043，China）

A high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection method was developed for simultaneous determination of Chloramphenicol（CAP），Thiamphnicol（TAP）and Florfenicol（FF）in fishery products. Chloramphenicols（CAPs）residues were extracted by basic ethyl acetate，followed by sample cleanup with n-hexane and quantization by liquid chromatography with ultraviolet detector.Good linearities were obtained in the concentration ranging from 0.10～10.00mg/L for CAP，TAP and FF.The average recoveries and relative standard deviations（RSDs）for the analysis of all samples fortified over the range of 0.25～5.00mg/kg were in the range of 81.00%～102.93%and 1.95%～7.10%，respectively.The limits of detection were 0.01mg/kg for CAP and 0.02mg/kg for TAP and FF.

HPLC；chloramphenicol；thiamphnicol；florfenicol；fishery products；residue

ST207.5

A

1002－0306（2012）20－0080－04

2012－05－14 *通讯联系人

陶昕晨（1988－），男，硕士研究生，主要从事食品质量与安全方面的研究。

湛江市财政资金科技专项项目（2011D02）。