张利燕，常 虹 ，赵丽芹，周家华

（1.内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特010018;

2.北京市农林科学院农业综合发展研究所，北京 100097）

理化因素对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响研究

张利燕1，2，常 虹2，*，赵丽芹1，周家华2

（1.内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特010018;

2.北京市农林科学院农业综合发展研究所，北京 100097）

本文从板栗花雄花序中提取黄酮类化合物，采用紫外分光光度法研究理化因素对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响。结果表明:自然光对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基的能力有影响;温度对其影响不明显;在pH3～5的弱酸性条件下清除DPPH自由基的能力较高，在强酸强碱溶液中清除DPPH自由基的能力较低;金属离子Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+对其清除DPPH自由基能力的影响不明显，Al3+影响较明显。

理化因素，黄酮，清除力，DPPH自由基

花粉集中了植物体的精华，营养十分丰富，在国际上有“完全营养品”、“微型营养库”之称，是天然的绿色营养品。板栗花为壳斗科（Fagceae）栗属植物栗（Castanea mollissima Blμme）的雄性花序，其花粉含丰富的活性钙、磷、维生素E、雌二醇、黄酮、蛋白质等生物活性物质［1］。板栗花雄花序可以增强血管张力、降低血管脆性、改善血管通透性、降低血脂及胆固醇;减少红血球和血小板聚集、减少血栓的形成;护肝解毒、提高机体免疫力;抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗真菌、抑制肿瘤等［2－3］。在食品、药品、保健品、化妆品等诸多领域具有开发应用价值。板栗花中的黄酮物质是所有花粉中含量最高的［4］，凝聚了天然、绿色、营养、保健等特点。研究表明:黄酮类物质具有抗菌、抗病毒、抗过敏、抗衰老、抗肿瘤及降血脂等多种生物活性;此外，黄酮类物质还是一种天然的自由基清除剂。人体在新陈代谢过程中，随着氧的消耗会生成许多自由基，这些自由基是许多生理和病理过程的积极参与者，对机体危害极大。因此寻找安全高效的天然自由基清除剂受到国内外的重视。目前，已经开发出了一些天然的自由基清除剂，但是，这些天然的自由基清除剂在何种理化条件下能发挥最大的清除能力还没有报道。本文研究了理化因素对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响，为科学合理地利用天然自由基清除剂使其发挥最大自由基清除效能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

板栗花雄花序 2011年7月采于河北怀柔，自然阴干;DPPH（2，2－dipheny－l 1－picrylhydrazyl） 分析纯，美国SIGMA公司;氯化钠、氯化钾、氯化铁 分析纯，国药集团化学试剂有限公司;氯化钙、硫酸镁、硝酸铝 分析纯，西陇化工股份有限公司;无水乙醇 分析纯，北京化工厂。

TU－1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;HHS型电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;LP－503电子天平 常熟市衡器厂;R－201型真空旋转蒸发仪 配有SHB－Ⅲ循环水式多用真空泵，上海申科机械研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 板栗花雄花序黄酮类化合物的提取 采用乙醇热回流浸提法提取板栗花雄花序中的黄酮类化合物［5］。乙醇浓度 70%，浸提温度 60℃，料液比 1∶20，回流提取2次，每次2h，除去残渣后旋转蒸发回收溶剂。浓缩溶液经真空冷冻干燥得到板栗花雄花序黄酮提取物样品，放入干燥器中备用。

1.2.2 清除DPPH自由基能力的测定 在Bao等［6］所建立方法的基础上进行改良，用60%乙醇配制质量浓度为 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14mg/mL的Trobx溶液，DPPH用60%的乙醇配制成2×10－4mol/L的溶液。取1mL不同浓度的样品溶液与4mL 2×10－4mol/L的DPPH溶液于具塞试管中，摇匀反应30min后，于517nm处测定吸光度值，用60%乙醇溶液作参比。取3次实验的平均值计算清除率。

式中:A1表示4mL 2×10－4mol/L DPPH溶液加入1mL60%乙醇溶液的吸光度;A2表示4mL 2×10－4mol/L DPPH溶液加入1mL样品溶液的吸光度。1.2.3 自然光对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响 用60%乙醇配制质量浓度为 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22mg/mL的Trobx溶液，分成两组，一组放在自然光照下，一组放在避光处，连续3d测定其对DPPH自由基的清除能力。

1.2.4 温度对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响 准确量取质量浓度为0.2mg/mL的Trobx溶液25mL共8份，置密闭容量瓶中，分别在30、40、50、60、70、80、90、100℃ 的水浴条件下保温30min，冷却至室温后测定其清除DPPH自由基的能力。

1.2.5 pH对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响 准确量取质量浓度为0.2mg/mL的Trobx溶液25mL共10份，用1mol/L HCl、NaOH调至其 pH 为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，然后测定其清除DPPH自由基的能力。

1.2.6 金属离子对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响［7］配制浓度为0.1mol/L的 K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Al3+，0.3mg/L 的 Fe3+溶液，在50mL 0.2mg/mL的Trobx溶液中分别加入0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mL 的各种金属离子溶液，混匀，放置1、24h后分别测定其对DPPH自由基的清除能力。

1.2.7 氧化剂、还原剂对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响 准确量取50mL 0.2mg/mL的Trobx溶液10份，分别加入体积分数均为 0.01mL 的 H2O2、Na2SO30.05、0.10、0.15、0.20、0.25mL，混匀，放置1、24h后分别测定其对DPPH自由基的清除能力。

2 结果与分析

2.1 板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基的能力

DPPH法［8］自上世纪五十年代开始就用于天然产物的H－供体测定，后用于单一抗氧化物或天然物质的抗氧化能力测试。DPPH是一种性质较为稳定的自由基，溶于甲醇、乙醇等极性溶剂中，在517nm处有最大吸收，当有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子由于被配对，会发生脱色反应，因此可用吸光度的变化并以Trolox等作为对照体系量化抗氧化物质的抗氧化能力。其对DPPH自由基的清除能力用IC50表示［9］。本研究利用该法来测定板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基的能力及理化因素对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响。

图1显示，在一定浓度范围内，随着试样浓度的增大，对DPPH自由基的清除能力增大，并且浓度和清除率有很好的量效关系。半数抑制浓度IC50为0.068mg/mL，由此可见，板栗花雄花序黄酮提取物对DPPH自由基的清除能力很强，是一种很好的天然抗氧化剂，可以添加到食品、药品或保健品等中。

图1 板栗花雄花序黄酮提取物对DPPH自由基的清除Fig.1 Flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

2.2 自然光对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响

图2、图3显示，在自然光照条件下，随存放时间的延长其清除DPPH自由基的能力降低;在避光条件下，随存放时间的延长其清除力降低减缓。表明自然光对板栗花雄花序黄酮提取物有降解作用，因此，板栗花雄花序黄酮提取物应避光保存，作为抗氧化剂或自由基清除剂添加到食品或保健品等中时［10］，其相应的食品或保健品等最好避光存放，以使板栗花雄花序黄酮提取物在食品或保健品存放过程中发挥其更大的抗氧化或自由基清除作用，延长食品或保健品的贮藏期，提高产品质量。

图2 自然光下板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基的能力Fig.2 Flavonoid extractied from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical in the natural light

图3 暗光下板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基的能力Fig.3 Flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical in the dim light

2.3 温度对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响

图2、图3表明，板栗花雄花序黄酮提取物的浓度达到0.18mg/mL时对DPPH自由基的清除率最大，之后随Trobx溶液浓度的增大清除率趋于稳定。为了计算方便及减小系统误差选择0.2mg/mL的Trobx溶液做理化因素对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响。图4表明，随着加热温度的升高，板栗花雄花序黄酮提取物对DPPH自由基的清除率变化不明显。因此，温度对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基的能力没有影响，板栗花雄花序黄酮提取物可作为天然抗氧化剂或自由基清除剂添加到需要热处理的食品、保健品等中。

图4 温度对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响Fig.4 Temperature influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

2.4 pH对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响

图5表明，在pH3～5的弱酸性条件下，板栗花雄花序黄酮提取物对DPPH自由基的清除力较高;在强酸性条件下，其对DPPH自由基的清除力减小;在强碱性条件下其对DPPH自由基的清除力降到较低。因此，板栗花雄花序黄酮提取物适合添加在弱酸性的食品、保健品等中，以发挥其最大功效。

图5 pH对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响Fig.5 pH influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

2.5 金属离子对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响

图6～图11 表明，放置 1、24h 后，K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe3+对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基的能力影响不明显。Al3+对其影响较明显，放置1h后，随着Al（NO3）3添加量的增加，其对DPPH自由基的清除力逐渐降低;放置24h后，随着Al（NO3）3添加量的增加，其对DPPH自由基的清除力降得更低。因此，板栗花雄花序黄酮提取物作为抗氧化剂或自由基清除剂使用时，应避免与Al3+接触，以免影响其抗氧化能力。

图6 NaCl对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响Fig.6 NaCl influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

2.6 氧化剂、还原剂对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响

图12、图13表明放置1、24h后氧化剂H2O2对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基的能力没有影响。还原剂Na2SO3的添加量为0.05、1mL时对其清除DPPH自由基的能力没有影响。当添加量大于1mL时，放置1h后，其清除力降低较明显，随添加量的增加其清除力逐渐降低，再放置24h后其清除力有所回升。因此，板栗花雄花序黄酮提取物在

图7 KCl对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响Fig.7 KCl influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

图8 MgSO4对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响Fig.8 MgSO4influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

图9 Al（NO3）3对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响Fig.9 Al（NO3）3influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

图10 CaCl2对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响Fig.10 CaCl2influence on flavonoid extraced from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

图11 FeCl3对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响Fig.11 FeCl3influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free

图12 氧化剂H2O2对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响Fig.12 Oxidizer（H2O2）influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

图13 还原剂（Na2SO3）对板栗花雄花序黄酮提取物清除DPPH自由基能力的影响Fig.13 Reducing agent Na2SO3influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

使用过程中应尽量避免与过量还原剂接触。

3 结论

3.1 板栗花雄花序黄酮提取物具有较强的DPPH自由基清除能力，是一种很好的天然抗氧化剂，可以添加到食品、药品、保健品等中。

3.2 板栗花雄花序黄酮提取物作为天然抗氧化剂或自由基清除剂使用时，可以添加到含有矿物质K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe3+及需要热处理的食品、药品、保健品等中，这些理化因素对其抗氧化性能的发挥没有影响。

3.3 板栗花雄花序黄酮提取物作为抗氧化剂或自由基清除剂添加到食品、药品、保健品等中时，最好选择微酸性、不含Al3+、不添加Na2SO3的食品、药品、保健品等中，以发挥其最大效能。板栗花雄花序黄酮提取物应避光保存，延长其抗氧化性能。

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Research on influence of physical and chemical factors to flavonoid extract of the male chestnut
flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

ZHANG Li－yan1，2，CHANG Hong2，*，ZHAO Li－qin1，ZHOU Jia－hua2
（1.Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China;2.Institute of Agricultural
Integrated Development，Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Beijing 100097，China）

The influence of physical and chemical factors to flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability of DPPH free radical was studied by Ultraviolet spectrophotometry.The results showed that the natural light had influence to flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical.The effect of temperature was not obvious.The scavenging ability of DPPH free radical was superior in the acidic condition of pH3～5，and the scavenging ability of DPPH free radical was lower in the strong acid and alkali solution.The effect of metal ions，Na+，K+，Ca2+，Mg2+，Fe3+on scavenging ability of DPPH free radical was not obvious.But the effect of Al3+was obvious.

physical and chemical factors;flavonoid;scavenging ability;DPPH free radical

TS255.1

A

1002－0306（2012）17－0081－05

2012－01－13 *通讯联系人

张利燕（1986－），女，硕士研究生，研究方向:功能成分提取及应用研究。

北京市农林科学院青年科研基金（QN201117）。