肖嫩群，刘洪娜，张华玲，曾奥，郭抗萧，陈海强，谭周进

1(湖南中医药大学药学院，湖南长沙，410208)

2(湖南中医药大学医学院，湖南长沙，410208)

3(湖南省食用菌研究所，湖南长沙，410013)

固态发酵生产蜜环菌饮料*

肖嫩群1，刘洪娜2，张华玲2，曾奥2，郭抗萧2，陈海强3，谭周进2

1(湖南中医药大学药学院，湖南长沙，410208)

2(湖南中医药大学医学院，湖南长沙，410208)

3(湖南省食用菌研究所，湖南长沙，410013)

以蜜环菌固态发酵物为原料制得一种蜜环菌饮料。以蜜环菌固态发酵物为原料，提取其中的多糖等营养和药效成分，进行风味调配，通过正交试验和感官评价的方法确定蜜环菌饮料的配方。该发酵饮料的培养基配方为:白砂糖1.5%，大米80%，黄豆1%，麸皮10%，红薯7.5%;饮料配方为:蜜环菌发酵液添加比例为30%、白砂糖为20 g/L、柠檬酸0.6 g/L、黄原胶0.2 g/L，测得成品饮料中各成分的含量为:多糖0.049 mg/mL，还原糖0.042 mg/mL，蛋白质53.0 mg/mL，氨基酸1.226 mg/mL。饮料的感官指标、理化指标和微生物指标均达国家标准。

蜜环菌饮料，多糖，食药用菌，固态发酵

蜜环菌(Armillariella mellea)是一种著名的药食兼用真菌[1］，菌体中富含多种生理活性物质，其所含多糖具有抗辐射、促进造血机能、调节免疫功能、抑制肿瘤生长等药理和保健功能[2］。蜜环菌富含多糖﹑粗纤维及多种人体必需的氨基酸，是一种营养价值很高的食品。国内外已有将蜜环菌开发成产品的相关报道，开发出脑心舒口服液、健脑露、蜜环菌浸膏、蜜环菌片和蜜环菌糖浆等多种蜜环菌制剂和产品[3］。

固态发酵具有投资少、能耗低等优点。本研究以蜜环菌固态发酵物为原料，制作蜜环菌营养保健饮料，充分利用蜜环菌发酵后的有效成分，配制工艺简单，成本低廉，为保护和人工开发真菌资源开辟新的途径，具有较好的市场前景。

1 材料与方法

1.1 材料

蜜环菌(由课题组从天麻中分离保存)、白砂糖、柠檬酸、黄原胶、苯甲酸钠、苯酚、浓硫酸、乙醇、无水乙醇、3，5-二硝基水杨酸、丙三醇、3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、丙三醇、牛血清白蛋白、磷酸、考马斯亮蓝-G250、酚酞、甲醛。

1.2 培养基

(1)斜面培养基:土豆20 g、葡萄糖2 g、KH2PO40.3 g、MgSO40.15 g、琼脂1.6～1.8 g，水100 mL，pH 6.5;121℃灭菌30 min。

(2)固态发酵培养基:采用5种不同培养基配方，首先按量称取各种配料，拌匀，清水拌湿，闷放约30 min，含水量达到70%～80%为宜，即手轻捏指缝间有水，滴出2～3滴为度。配方见表1。

表1 培养基配方(均为质量分数/%)

1.3 仪器

PL203电子天平，瑞士梅特勒;S.SW-CJ-1BU超净工作台，上海沪粤明科学仪器有限公司;DR9082电热恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司;HH-6恒温水浴锅，常州恒德仪器制造有限公司;7012S/7012G组织捣碎机，北京德泉兴业商贸有限公司;YXQ-SG46-280S高压蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司;722S分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

1.4 工艺流程

蜜环菌→活化→固态发酵→组织捣碎→热水浸提→4层纱布过滤→风味调配装瓶→灭菌→理化及微生物指标检[4］

1.5 操作要点

1.5.1 蜜环菌菌种活化

蜜环菌在无菌条件下用接种针挑取菌丝片段接种于斜面，27℃恒温培养，直至蜜环菌长满整个试管为止。

1.5.2 固态发酵培养

挑取斜面菌种，无菌操作分别接种到上述5种配方的固态培养基中，27℃恒温培养箱中培养，观察并记录各种培养基中蜜环菌的生长状况，包括开始萌发时间、生长的快慢及蜜环菌菌丝量等[5-6］。

1.5.3 组织捣碎及有效成分浸提

首先将固态发酵得到的蜜环菌称重，按质量比1∶5的比例加入水，一起倒入组织匀浆机中，打碎成浆液。匀浆后的发酵浆液置于60℃水浴锅中浸提30 min，以促使菌丝体自溶，有利于较多的营养物质溶于其中，然后用4层纱布分离并过滤，得到发酵匀浆滤液，如果滤液不够澄清可进行二次过滤。

1.5.4 调配

选取蜜环菌发酵液、砂糖、柠檬酸、黄原胶添加量4因素，进行4因素3水平的正交试验，配方设计如表2所示。

表2 正交试验因素与水平表

1.5.5 分装、杀菌、冷却

将调制好的产品分装到饮料瓶中，置于90℃水浴锅中灭菌30 min，自然冷却即为成品。

1.6 产品感官及评分标准[7-8］

由10人组成评定小组，按评定标准进行综合评定，去除最高分和最低分后，计算出平均分作为该样品的感官评分。评定标准:从色泽、气味、组织形态3个方面进行评分，总分为100分，其感官质量指标评分细则见表3。

表3 感官评分标准

1.7 成品饮料的微生物学指标检测[9］

1.7.1 菌落总数的测定

①梯度稀释液制备:以无菌操作制备蜜环菌饮料10倍递增稀释液②倾注培养:根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，本实验检测10-1、10-2、10-3三个稀释度，取1 mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15 mL，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1 mL稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置(36±1)℃温箱内培养(48±2)h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1 mL样品所含菌落总数。

1.7.2 大肠菌群数的测定

具体操作参见GB4789.3-1994《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》。

1.8 成品饮料中各成分含量的测定

1.8.1 多糖测定

采用苯酚-硫酸法[10-11］。首先将离心分离得到的滤液浓缩，加入3倍体积的75%的乙醇溶液沉淀过夜，3000 r/min离心15 min，得到的沉淀用75%的乙醇洗至无还原糖反应，再离心得到粗多糖，将离心得到的粗多糖溶于一定量的热水中，在490 nm的波长处比色测定吸光度。

1.8.2 还原糖测定

DNS法。吸取2 mL样液(可稀释适当倍数)，置于25 mL容量瓶中，再加入3，5-二硝基水杨酸溶液3 mL，沸水显色5min，然后以流水迅速冷却，用水定容至25 mL，摇匀，以试剂空白调零，在540nm处比色求出还原糖的量。

1.8.3 蛋白质测定

采用考马斯亮蓝G-250法[12］。取1支具塞试管，准确加入0.1 mL样品提取液，再加入0.9 mL蒸馏水，5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2 min后，在595 nm波长下比色，记录吸光度。根据所测样品提取液的吸光度计算蛋白质含量(μg)。

1.8.4 氨基酸测定

甲醛滴定法。

2 结果

2.1 蜜环菌固体发酵培养基

蜜环菌在不同培养基上的生长情况有较大差异，结果见表4。可以看出，蜜环菌在A、B、D三种培养基中均能生长，且B培养基中的蜜环菌在接种10 d左右后最先开始萌发，菌索生长的最快，生长状况最佳，大约45 d左右最先长满整个培养基。A、D培养基中的蜜环菌萌发的时间较晚，生长较慢。C中萌发时间最晚，且菌丝体几乎不长，可能是培养基中缺少蜜环菌生长所需的营养物质，而在E培养基中菌丝生长缓慢，且一段时间整个培养基开始变黑。由此确定培养基的最佳配方为B(白砂糖1.5%，大米80%，黄豆1%，麸皮10%，红薯7.5%)。

表4 蜜环菌在不同培养基上的生长情况

2.2 饮料配比的确定

为优化蜜环菌饮料的风味，本试验按4因素3水平正交试验表进行试验设计，分别以蜜环菌发酵液(A)，糖度(B)，酸度(C)，黄原胶(D)为4个试验因素，得到9个配方组合;并以10人的评审小组，按照感官评分标准，对调配样品进行品评，以感官指标总分为指标，对各处理的蜜环菌饮料的进行综合评价，确定最佳配方。配方的正交试验见表5。

表5 正交试验结果表

由正交表5可知，按级差(R)大小，影响感官指标总分的各因素的主次顺序分别为A＞D＞B＞C，即发酵液比例＞黄原胶＞砂糖＞柠檬酸。根据各水平下K1、K2、K3确定各因素的最优水平组合为:A3B3C1D3，即蜜环菌发酵液添加比例为30%、白砂糖为20 g/L、柠檬酸0.6 g/L、黄原胶0.2 g/L时，蜜环菌饮料酸甜适中，具有较浓郁的菌香味，且香气纯正口感协调柔和风味较佳。当发酵液的添加量为10%时，蜜环菌饮料香味较淡，几乎闻不到菌香;当发酵液的添加量为20%时，饮料菌香有所增加，但菌香不够浓郁;当发酵液的添加量达到30%时，饮料有较浓郁的菌香，口感纯正无其他异味。白砂糖的添加量为10 g/L时，饮料口味偏淡。白砂糖添加量20 g/L，柠檬酸的添加量为0.6 g/L时产品酸甜适中，当黄原胶的添加量为0.15 g/L时，饮料不稳定有沉淀产生，黄原胶添加到0.2 g/L时，饮料较为稳定，几乎无沉淀。

2.3 饮料微生物指标的检测结果

按照GB/T 4789.3-2003进行成品饮料的微生物学检测，结果表明，饮料中细菌总数小于10 CFU/mL，大肠菌群数不超过3个/100 mL，致病菌未检出，表明该饮料符合国家卫生标准。

2.4 饮料中各成分含量测定结果

经测定，饮料中多糖的含量为0.049 mg/L，还原糖的含量为0.042 mg/L，蛋白质的含量为53.0 mg/L，氨基酸的含量为1.226 mg/L。

3 结论

(1)蜜环菌固态发酵培养基配方为:白砂糖1.5%，大米80%，黄豆1%，麸皮10%，红薯7.5%。

(2)固态发酵蜜环菌所用原料一般为经济易得、富含营养物质的工农业副、废产品，如麸皮、薯粉、大豆饼粉、高粱、玉米粉等，而且固态发酵一般采用开放式，所需设备简单，易于操作，具有较广阔的市场前景[13］。

(3)本试验是采用蜜环菌固体发酵物经组织捣碎，将发酵物中菌丝体碎成桨，提取其中多糖等营养和药效成分而配制饮料，大大提高了饮料的营养及药理功效。

(4)饮料中含有较多的营养物质，如氨基酸、多糖等。

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ABSTRACTStudy on the method using solid fermentation as raw material for health beverage.Armillaria mellea fermentation solid was used as raw material to extract the polysaccharide and other nutritional and medicinal components.After flavor adjustment，the optimum formula of the beverage of armillaria was determined through orthogonal test and sensory evaluation method.The optimizing solid fermentation medium for Armillaria mellea contained sugar 1.5%，rice 80%，soybean 1%，bran 10%，sweet potato 7.5%.The best formula for beverage was as follows:30%armillaria fermented liquid，20 g/L sugar，0.6 g/L citric acid，and 0.2 g/L xanthan gum.The ingredients of the finished product drink were as follows:0.049 mg/mL polysaccharide，0.042 mg/mL reducing sugar，53.0 mg/mL protein，and 1.226 mg/mL amino acid.The senses index，physical and chemical indexes and microbiology indicators of drink have reached national standards.The Armillaria mellea beverage has unique taste and function for health care，it has great value in utilization.

Key wordsArmillaria mellea beverage，polysaccharide，edible fungi，solid fermentation

Studies on Armillaria mellea Beverage Produced by Solid Fermentation

Xiao Nen-qun1，Liu Hong-na2，Zhang Hua-ling2，Zeng Ao2，
Guo Kang-Xiao2，Chen Hai-Qiang3，Tan Zhou-Jin2
1(School of Pharmaceutical Sciences，TCM University of Hunan，Changsha 410208，China)
2(School of Medicine，TCM University of Hunan，Changsha 410208，China)
3(Hunan Domestic Fungus Research Institute，Changsha 410013，China)

硕士，实验师(谭周进教授为通讯作者，E-mail:tanzhjin@sohu.com)。

*长沙市科技局项目(No.k0803270-31);“十一五”国家科技支撑计划课题(No.2008BADAIB07);湖南省中医药管理局课题(2010110)

2012-03-01，改回日期:2012-06-03