乌日娜，岳喜庆，张和平

1(沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳，110866)

2(内蒙古农业大学教育部乳品与生物技术重点实验室，内蒙古呼和浩特，010018)

益生菌Lactobacillus casei Zhang在酸胁迫下的蛋白质组学研究*

乌日娜1，岳喜庆1，张和平2

1(沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳，110866)

2(内蒙古农业大学教育部乳品与生物技术重点实验室，内蒙古呼和浩特，010018)

Lactobacillus casei Zhang是1株筛选自发酵酸马奶，并具有耐酸等益生特性的益生乳杆菌。该研究利用蛋白质组双向电泳，比较了其在pH值为7.0和5.5的培养液中分别生长至对数生长期中期的蛋白质组表达差异。结果表明，有11个蛋白质点表达发生明显变化，经过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱鉴定，其中有3个表达增强的蛋白质点分别鉴定为翻译因子(EF-Tu)，N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱醛酶(NagA)和小热休克蛋白(sHsp)。酸胁迫可诱导乳酸菌产生复杂的酸应激反应，涉及不同的代谢调控途径。

Lactobacillus casei Zhang，蛋白质组，酸胁迫

酸马奶是由乳酸菌和酵母菌发酵而成的酒精性饮料，在中国的内蒙古、蒙古和俄罗斯等地十分流行。研究显示，干酪乳杆菌属是采集于内蒙古地区的酸马奶样品中的优势乳杆菌发酵剂[1］。张和平教授等从中筛选出1株益生菌Lactobacillus casei Zhang。该菌株具有较强的耐酸和耐胆盐特性，且可对小鼠的细胞免疫功能产生多方面的、有利于机体免疫功能的调节作用[2-3］。

耐酸特性是筛选益生菌的一个基本条件，因为当益生菌以制剂或与食品口服，需要经过胃部的酸性环境胁迫，并且达到一定的活菌数，才有可能进入肠道进而定植。为了探索益生菌对酸胁迫产生的应激反应机理，蛋白质组学技术是十分有效的方法之一。蛋白质组(proteome)是指由1个基因组所表达的全套蛋白质[4］。双向凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)是蛋白质组学研究的核心技术，由O＇Farrell等提出[5］。利用双向电泳技术构建蛋白质表达图谱，可以分离得到数以百计的蛋白质。然而，有关乳酸菌蛋白质组学的研究开展较晚。目前国外已报道了Lactococcus lactic[6］和双歧杆菌Bifidobacterium longum[7］，及部分乳杆菌 Lactobacillus sanfranciscensis[8］，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus[9］，Lactobacillus reuteri[10］等在酸胁迫下的蛋白质组学研究。结果表明，酸胁迫条件可诱导乳酸菌蛋白质表达发生变化。但是，上述研究多以酸适应性反应(acid tolerance response，ATR)为酸胁迫的条件，而对乳酸菌在酸环境下生长的蛋白质组学研究较少。

本项研究以益生菌L.casei Zhang为研究对象，利用双向电泳技术构建了该菌株在pH值分别为7.0和5.5的培养条件下对数生长中期的蛋白质组表达谱，并且进行了差异比较分析，为揭示其中可能与L.casei Zhang耐酸特性的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种:干酪乳杆菌L.casei Zhang，由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。

改良MRS培养基:蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏粉 10 g，葡萄糖 20 g，吐温-801g，K2HPO42 g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，MgSO4·7H2O 0.2 g，Mn-SO4·4H2O 0.05 g。

试剂:MES、MOPS，北京天为时代公司;丙烯酸胺、Tris、SDS、TEMED、N，N＇-甲叉双丙烯酞胺、硝酸银、三氯乙酸，美国 Sigma公司;尿素、硫脲、DTT、CHAPS、碘乙酰胺、考马斯亮蓝、IPG(Immobilized pH gradient)干胶条(18 cm、pI 4～7)，美国Bio-rad公司;正丁醇、过硫酸胺、无水乙酸钠、丙酮、EDTA、Na2S2O3、Na2CO3等。

1.2 仪器与设备

等电聚焦仪、Ettan DALT Twelve system装置、Image Scanner扫描仪及Image Master 5.0图像分析系统，美国GE公司;TGL-168低温离心机，德国Eppen-dorf公司。

1.3 实验方法

1.3.1 干酪乳杆菌的培养

将活化3代的L.casei Zhang供试菌液以1%的量(OD600nm约为0.06)分别接种于新鲜的MRS培养基中，培养基中含有100 mmol/L的MES和MOPS缓冲剂，pH值分别为 pH7.0和 pH5.5(用 KOH调节)[11］。以每管5 mL的量分装试管，37℃恒温培养箱中培养24 h。每隔1 h取样，绘制L.casei Zhang在不同pH值条件培养下的生长曲线。

1.3.2 蛋白质样品的提取与制备

离心收集对数生长中期的菌体，利用研钵将收集的菌体进行液氮研磨破碎，然后采用TCA/丙酮沉淀法制备蛋白质样品[5，12］。利用 Bradford法测定蛋白质浓度。

1.3.3 双向凝胶电泳[13］

将菌体蛋白样品100 μg加入溶胀液中，使总体积为350 μL。充分混匀后，将其加入到持胶槽中，并将IPG干胶条，胶面向下放于样品之上进行溶胀。胶条溶涨后，进行第一向等电聚焦。等电聚焦参数为:无电压6 h，50 V 恒电压电泳6h;250、500、4000 V和8000 V线性梯度电压电泳1 h，再以8000 V电压电泳65000 V·h。聚焦结束后，将胶条分别放入含有1%浓度DTT的SDS平衡液和含有2.5%浓度的碘乙酞胺SDS平衡缓冲液中，于摇床上平衡15 min。然后，将胶条转移至12%的SDS聚丙烯酞胺凝胶(26 cm×20 cm)，进行电泳，约5～6 h后，停止电泳，取下凝胶采用银染法进行染色。

1.3.4 图像分析及质谱鉴定

利用Image 5.0图像分析软件对凝胶图像进行分析。选取同一条件下的2块平行胶构建一个参考胶，然后通过参考胶蛋白质量(volume)的匹配和比较进行不同条件下蛋白质表达的分析，对能匹配上的点进行位置和量重复性分析，对不能匹配上的点进行差异表达量分析。

从胶上选取差异蛋白点，切下后，经胰酶消化，并利用MALDI-TOF/MS质谱对肽段样品进行鉴定。质谱参数设置为默认值，加速电压19 kV，m/z范围为600～4000，误差范围为10 ppm。通过软件MASCOT software 1.9(Matrix Science)，以NCBInr数据库中革兰氏阳性菌已知数据为基础，进行蛋白质序列数据库检索鉴定。

2 结果与分析

2.1 不同pH值条件下生长曲线的绘制

L.casei Zhang在pH7.0和pH5.5的MRS培养基中生长，其生长曲线如图1所示。在低pH条件下，细菌总数明显降低，说明该菌株的生长受到抑制。此外，缓冲剂的加入，使L.casei Zhang在进入稳定期前可维持初始pH在±0.1～±0.3的范围内缓慢降低，可基本维持pH7.0和pH5.5，在进入稳定期后，培养液的pH值才会显著下降。

图1 干酪乳杆菌在不同pH值条件下的生长曲线

2.2 双向电泳图像分析

图2 L.casei Zhang在不同pH下生长至对数生长期中期的蛋白质组双向电泳表达图谱

利用双向电泳技术，试验中构建了 L.casei Zhang在不同pH值下生长的蛋白质组2-DE图谱(图1)。通过Image 5.0图像分析，结果表明，2块平行胶的匹配率均在90%以上，可检测到的斑点分别为493 ±6(pH 7.0)和496±8(pH 5.5)。

2.3 双向电泳差异表达谱比较

经Image 5.0图像分析软件比较分析显示，L.casei Zhang在pH7.0和pH5.5生长至对数生长中期的2-DE表达谱中，有11个蛋白质点表达发生明显变化(2.5倍以上)，如表1所示。

表1 L.casei Zhang在pH7.0和pH5.5培养基MRS中生长至对数生长期中期的差异表达蛋白质

由表1可知，在11个差异表达蛋白质点中，3个差异表达蛋白质点可通过质谱技术鉴定为对应的蛋白，有8个差异表达蛋白质点未鉴定出匹配结果。其中，有6种蛋白质在稳定期表达强度增强2.5倍以上，包括翻译因子(EF-Tu，spot Z1)，N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱醛酶(NagA，spot Z4)，小热休克蛋白(sHsp，spot Z10)，及未鉴定出的蛋白质点(spot Z2，spot Z5和 spot Z8);而有3个蛋白质(spot Z6，spot Z7，spot Z9)的表达量在稳定期下降;有2个蛋白质点分别只在pH 7.0(Unidentified，spot Z11)或者pH 5.5对生长期表达(Unidentified，spot Z3)。

3 讨论

酸胁迫可诱导乳酸菌产生复杂的酸应激反应，涉及不同的代谢调控途径。L.casei Zhang在pH5.5的MRS生长，与在pH7.0的MRS生长的2-DE图谱差异比较分析，由酸诱导表达上调的3种蛋白质，就属于应激蛋白、糖代谢和翻译代谢调控3种不同的路径。此外，在L.casei Zhang对数生长期与稳定期生长的2-DE比较研究中，这3种蛋白质的表达量在稳定期时也强于对数期。

3.1 应激蛋白质

L.casei Zhang中小热休克蛋白(sHsp，spot Z10)在pH 5.5时表达增强。热休克蛋白质是被较早发现的一类应激蛋白质，具有修复或解折叠损伤蛋白质的生物学功能[14］。热休克蛋白 GroEL(Hsp 60)和DnaK(Hsp 70)是较为常见的应激反应蛋白质，多个蛋白质组研究都报道了不同乳酸菌在酸应激反应下被诱导，并且，不同的环境胁迫也可诱导GroEL和DnaK产生表达量的变化[15］。目前，有关乳酸菌小热休克蛋白的研究相对较少。

3.2 糖代谢及细胞膜保护作用

NagA可催化氨基糖类的代谢，及催化N-乙酰-D-6-磷酸葡萄糖胺与D-6-磷酸果糖的转化，而N-乙酰-D-6-磷酸葡萄糖胺是N-乙酰-D-葡萄糖胺和UDP-N-乙酰胞壁酸的前体，所以，NagA与细菌细胞壁肽聚糖和磷壁酸的合成有关[16］。细胞壁是细菌抵抗外界环境的第一道屏障。NagA的表达量在低酸是表达量增强，有利于维持细胞形态，增强细胞壁的保护作用。

3.4 翻译因子

L.casei Zhang的延伸因子EF-Tu在pH5.5时有明显增强，它的主要功能不仅是传送aminoacyl-tRNA到核糖体，同时对Escherichia coli的研究表明，EF-Tu与蛋白质的折叠或应激保护有关[17-18］。L.reuteri和P.freudenreichii[10，19］的蛋白质组研究报道，酸胁迫可诱导相应的EF-Tu蛋白发生表达量发生变化。因此可能说明，L.casei Zhang的EF-Tu的变化与其酸应激反应有关。

未鉴定出结果的差异表达蛋白质斑点可能在L.casei Zhang的耐酸生长过程中起到重要作用，因此，下一步笔者将继续完成蛋白质点的鉴定及验证工作。

[1]孟和毕力格，乌日娜，王立平，等.不同地区酸马奶中乳杆菌的分离及其生物学特性的研究[J］.中国乳品工业，2004，32(11):6-7.

[2]张和平，孟和毕力格，王俊国，等.分离自内蒙古传统发酵酸马奶中L.casei Zhang潜在益生特性的研究[J］.中国乳品工业，2006，34(4):4-10.

[3]Wu Ri-na，Wang Li-ping，Wang Ji-cheng，et al.Isolation and preliminary probiotic selection of Lactobacilli from poumiss in Inner Mongolia[J］.Journal of Basic Microbiology，2009，49(3):318-326.

[4］ 贺福初.蛋白质组学研究——后基因组时代的生力军[J］.科学通报，1999，44(2):113-122.

[5]乌日娜，张和平，孟和，等.干酪乳杆菌蛋白质双向电泳条件优化及图谱建立[J］.食品与生物技术学报，2009，28(5):598-602.

[6]Budin-verneuit A，Pichereau V，Aauffray Y，et al.Proteomic characterization of the acid tolerance response in Lactococcus lactis MG1363 [J］.Proteomics，2005，5(18):4794-807.

[7]Sanchez B，Champomier-Verges M，Collado M C，et al.Low-pH adaptation and the acid tolerance response of Bifidobacterium longum[J］.Applied Environment Microbiology，2007，73(20):6450-6459.

[8]De Angelis M，Gobbetti M，Bini L，et al.The acid-stress response in Lactobacillus sanfranciscensis CB1[J］.Microbiology，2001，147(7):1863-1873.

[9]Lim E M，Ehrlich D S，Maguin E.Identification of stress-inducible proteins in Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus[J］.Electrophoresis，2000，21(12):2557-2561.

[10]Lee K，Lee H G，PI K，et al.The effect of low pH on protein expression by he probiotic bacterium Lactobacillus reuteri[J］.Proteomics，2008，8(8):1624-1630.

[11]Blankenhorn D，Phillips J，Slonczewski J L.Acid-and base-induced proteins during aerobic and anaerobic growth of Escherichia coli revealed by two-dimensional gel electrophoresis[J］.Journal of Bacteriology，1999，181(7):2209-2216.

[12]Wu Ri-na，Sun Zhi-hong，Wu Jun-rui，et al.Effect of bile salts stress on protein synthesis of Lactobacillus casei Zhang revealed by two-dimensional gel electrophoresis[J］.Journal of Dairy Science，2010，93(8):3858-3868.

[13]Wu Ri-na，Wang Wei-wei，Yu Dong-liang，et al.Proteomics analysis of Lactobacillus casei Zhang，a new probiotic bacterium isolated from traditionally home-made koumiss in Inner Mongolia of China[J］.Molecular＆Cellular Proteomics 2009，8(10):2321-2338.

[14］ 乌日娜，武俊瑞，孟和，等.乳酸菌酸胁迫反应机制研究进展[J］.微生物学杂志，2007，27(2):62-66.

[15]De Angelis M，Gobbetti M.Environmental stress responses in Lactobacillus:A review[J］.Proteomics，2004，4(1):106-122.

[16]Vincent F，Yates D，Garman E，et al.The Three-dimensional structure of the N-Acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase，NagA，from Bacillus subtilis[J］.Journal of Biological Chemistry，2004，279(4):2809-2816.

[17]Stark H，Rodnina M V，Wieden H J，et al.Ribosome interactions of aminoacyl-tRNA and elongation factor Tu in the codon-recognition complex[J］.Nature Structural Biology，2002，9(11):849-854.

[18]Caldas T D，Yaagoubi A E，Richarme G.Chaperone properties of bacterial elongation factor EF-Tu[J］.Journal of Biological Chemistry，1998，273(19):11478-11482.

[19]Leverrier P，Vissers J P C，Rouault A，et al.Mass spectrometry proteomic analysis of stress adaptation reveals both common and distinct response pathways in Propionibacterium freudenreichii[J］.Architect Microbiology，2004，181(3):215-230.

ABSTRACTLactobacillus casei Zhang，isolated from traditional home-made koumiss in Inner Mongolia of China，has been considered as a new probiotic bacterium for its characteristics，especially acid tolerance.Proteomics researches were carried out to identify proteins expression of Lactobacillus casei Zhang grown at different pH values of pH 7.0 and 5.5.Cytosolic proteins of mid-exponential phase were resolved and further analyzed by two-dimensional gel electrophoresis.As results shown，eleven protein spots were found showing statistically significant differences.Three of total protein spots were identified as EF-Tu，NagA and sHsp using matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry(MALDI-TOF/MS)，indicating the complex response of lactic acid bacteria to acid stress.

Key wordsLactobacillus casei Zhang，proteomics，acid stress

Proteomics Researches on Acid Response of Lactobacillus casei Zhang Grown at Different pH Values Using Two-Dimensional Gel Electrophoresis

Wu Ri-na1，Yue Xi-qing1，Zhang He-ping2
1(College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China)
2(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Bioengineering，Ministry of Education，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China)

博士研究生(张和平教授为通讯作者)。

*国家自然科学基金项目(31025019;31000805);教育部创新团队发展计划(IRT0967);973计划前期研究专项基金项目(2010CB134502);教育部创新团队发展计划(IRT0967);“863”计划项目(2011AA100902);辽宁省高等学校优秀人才支持计划(LJQ2011071);沈阳农业大学“天柱山英才计划”

2012-02-03，改回日期:2012-06-11