王金，蔡谨，施周铭，黄磊，徐志南

(浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江杭州，310027)

以木薯渣水解液为碳源固定化发酵产丁酸工艺的研究*

王金，蔡谨，施周铭，黄磊，徐志南

(浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江杭州，310027)

利用廉价的非粮原料及采用新型高效的固定化发酵技术对于实现丁酸的工业化发酵生产具有重要意义。文中研究了纤维床生物反应器组成形式对固定化酪丁酸梭菌产丁酸过程的影响，结果表明，采用纤维床生物反应器四柱并联发酵时，丁酸终浓度比单柱发酵提高7.19%，尤其是产率提高了136.7%。以木薯渣水解液为碳源，利用纤维床生物反应器四柱并联进行丁酸批次发酵和补料发酵。批次发酵产丁酸浓度达到25.2 g/L，得率0.46 g/g，采用补料发酵，丁酸终浓度可达61.4 g/L。

固定化发酵，木薯渣水解液，丁酸，补料发酵

丁酸是一种重要的短链脂肪酸，在食品、化工、医药等方面有重要的应用[1］。以其为前体生产的脂类可以用作食品添加剂来增加食物的香味。丁酸还能用于医药中间体的制备，如(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯是用于合成多种血管紧张素转化酶抑制剂的重要中间体，可用于治疗高血压和充血性心力衰竭等心血管疾病。此外，丁酸钠盐还可作为替代抗生素的饲料添加剂饲喂家禽，以促进生长。

目前，丁酸的工业生产以化学合成法为主，其中以间歇式丁醛氧化法[2］最为普遍，但其工艺复杂，环境污染严重。随着化石性资源日渐枯竭，传统化工造成环境污染以及人们对生物基化学品需求的快速增加，化学工业呈现出从石油基到生物基的转变趋势。另外，由于丁酸和下游衍生产品有相当比例应用于食品、饲料和医药等行业，从生物质出发经生物合成的丁酸(即生物丁酸)更受欢迎。目前，相关的研究仅限于实验室，尚未实现工业化生产。其中主要问题是生物发酵法生产丁酸存在原料成本高、单位体积产量低和生产效率低等缺点，使其始终无法替代化学合成法。因此，研究人员一方面需要寻找和利用廉价的基质原料，另一方面需要探索高效稳定的发酵工艺。

为了降低发酵法生产丁酸的成本，研究者曾尝试利用各种廉价原料和废弃物发酵生产丁酸，如乳清[3］、玉米芯水解液[4］、玉米粉以及废糖蜜[5］等。木薯渣是木薯提取淀粉后的废弃物。目前全国每年产生的木薯渣为30万t左右，除少量被用作饲料外，大量被废弃，不仅造成资源浪费，还带来环境污染问题。虽然以木薯淀粉及其水解物为发酵底物的研究很多[6-8］，但利用木薯渣水解液作为发酵底物的研究[9-11］较少。

利用纤维床生物反应器[12］固定化发酵有利于提高发酵的产物浓度和生产效率。但是，目前这种反应器的应用仅限于实验室小规模，且单个使用，发酵周期相对较长。

本文针对以上两个问题，研究了多柱式纤维床生物反应器固定化发酵产丁酸的可行性，并探索了以木薯渣水解液为碳源多柱式纤维床生物反应器固定化发酵产丁酸的工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum ZJU8235)，由浙江大学生物工程研究所选育和保藏。

葡萄糖，中国医药集团上海化学试剂公司;硫酸铵、磷酸氢二钾、盐酸半胱氨酸盐、硫酸亚铁，上海生工生物工程有限公司;刃天青，Sigma公司;酵母粉、蛋白胨，BBI公司。

立式压力蒸汽灭菌锅、HHS型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂;AnkeTGC-16C离心机，上海安亭科学仪器厂;YQX-II厌氧培养箱，上海跃进医疗器械厂;5L体系发酵罐，德国B-Braun公司;6820气相色谱仪系统，Agilent Technology公司;紫外/可见分光光度计，Amershan Biosciences公司;AL104电子天平MP120-BLE便携式酸度计，Mett-ler Toledo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 木薯渣的预处理

在高压蒸汽(121℃)条件下，木薯渣与0.3 mol/L H2SO4固液比1∶10，水解反应30 min。将得到水解反应液调pH至6.0，过滤得滤液，测定其还原糖含量。

1.2.2 培养基的配制

种子培养基(1 L):30 g葡萄糖，5 g酵母粉，5 g蛋白胨，3 g(NH4)SO4，1.5 g K2HPO4，0.6 g Mg2SO4，0.03 g FeSO4，0.3 g半胱氨酸-HCl(作为还原剂)，0.5 mL 0.1%刃天青(作为无氧指示剂)，在沸水浴中煮沸除氧，培养基在121℃下灭菌30 min。培养条件为37℃，pH6.0。发酵培养基中碳源为60 g/L葡萄糖或者木薯渣水解液，其它成分与种子液相同。充氮气，保持罐中无氧环境。

1.2.3 利用纤维床生物反应器系统进行丁酸发酵

纤维床生物反应器的制作方法见文献[3］。本文设计的纤维床生物反应器发酵系统由一个5 L的机械搅拌式预发酵罐、1～4个500 mL的相互串联或并联连接的纤维床生物反应器以及pH控制器、循环水保温系统、供氮气瓶等组成。纤维床生物反应器和罐体构成一个循环回路(见图1)。整个发酵系统在121℃下灭菌30 min，通无菌氮气使罐内达到厌氧状态，接入100 mL种子液于5 L发酵罐内(装液量为2 L)，搅拌转速控制在 150 r/min，温度 37℃，维持pH6.0。待发酵罐中OD值达到4.0时即开启纤维床生物反应器，初始循环速度为60 mL/min，12 h后，流速提高到120 mL/min。

图1 多柱并联固定化发酵装置图

以葡萄糖为碳源进行了多柱串并联纤维床生物反应器发酵产丁酸的动力学研究。批次发酵时每当发酵液中碳源浓度接近0时，即放料并补入无菌新鲜培养基进行下一批次发酵。补料发酵是当碳源浓度接近0时，补入高浓度葡萄糖液，直至丁酸产量不再提高。

在以上基础上，进行以木薯渣水解液为碳源的纤维床生物反应器发酵产丁酸的动力学研究。在批次发酵过程中，当发酵液中糖浓度接近0时即补入以木薯渣水解液为碳源的新鲜培养基。补料发酵时，每当碳源浓度接近0时即补入浓缩的木薯渣水解液。每隔4h取样检测细胞浓度、底物浓度以及产物含量。

1.3 分析方法

1.3.1 菌体含量测定

用分光光度计测定600 nm下的吸光值。

1.3.2 还原糖含量测定

将发酵液10000 r/min离心5 min后稀释20～100倍，采用DNS法测定其中的还原糖含量。

1.3.3 丁酸和乙酸测定

采用安捷伦6820型气相色谱系统检测，以内标法定量分析发酵液中丁酸和乙酸浓度。发酵液经10000 r/min离心后取上清液1 mL，加入内标物丙酸30 μL，进样量0.4 μL，检测所用流动相为高纯氮气，色谱柱为HP-INNOWAX毛细管柱(30 m×0.32 mm)，检测器为氢火焰离子化检测器，流速为3 mL/min。测定条件:柱温250℃，FID检测器，进样口温度250℃。

2 结果和讨论

2.1 多柱串并联固定化发酵产丁酸工艺研究

生物丁酸只能利用酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)等厌氧微生物经厌氧发酵获得。固定化发酵被证实能有效降低发酵成本并大幅提高厌氧发酵的产物终浓度。美国俄亥俄州立大学的杨尚天教授等人在传统的填充床反应器(packed bed reactor，PBR)的基础上设计出一种简单、高效的纤维床生物反应器，适用于厌氧性微生物发酵。但是，目前这种反应器的应用仅限于实验室小规模(反应器体积小于1 L)，若单纯放大体积，将无法解决复杂的多相传质问题和填充物强度不足等问题。本文尝试在此基础上，通过数个纤维床生物反应器的串联或并联，以提高固定化发酵产丁酸的反应效率。

所谓的串联是前一个纤维床生物反应器的物料出口与下个纤维床生物反应器的物料进口依次连接，形成串联式纤维床生物反应器;而并联是所有纤维床生物反应器的物料进口并联成一个共同的物料进口，所有纤维床生物反应器的物料出口并联形成一个共同的物料出口，形成并联式纤维床生物反应器。在各个纤维床生物反应器的物料进口和物料出口管道上设置泵和流量计，将预发酵罐的出料口与多联纤维床生物反应器的物料进口相连接，预发酵罐的进料口与多联纤维床生物反应器的物料出口相连构成封闭循环系统。实验中以葡萄糖做碳源分别进行了2～4个纤维床生物反应器相互串联或相互并联发酵产丁酸的动力学研究，并与单柱式纤维床生物反应器发酵产丁酸进行比较，结果见图2。

图2 多柱串并联固定化发酵葡萄糖产丁酸结果比较

从图2中可以看出，随着柱子数量的增加，丁酸终浓度不断增加，相应产率大幅提高。四柱并联与单柱发酵相比，丁酸终浓度提高7.19%，产率提高136.7%。另外，柱子数量的增加与丁酸得率的增长呈现一定程度的正相关。这可能是由于固定的菌体占总菌体量比例较大，因而营养物质流向细胞生长方向的较少。串联模式未能明显提高发酵液中丁酸浓度。双柱并联与串联相比，产率高出69.32%。可能是因为串联模式下培养基流动阻力较大，且流动过程中pH值降低造成产酸速率较低。

2.2 木薯渣水解液为碳源四柱并联批次发酵产丁酸工艺

木薯渣经上述预处理得到木薯渣水解液，经DNS法测定，其还原糖浓度为55.4 g/L。以木薯渣水解液为葡萄糖的替代碳源，有利于进一步降低发酵成本。本文以木薯渣水解液为碳源进行了四柱并联固定化反复批次发酵产丁酸动力学研究，结果如图3所示。对全部6个批次的发酵参数进行比较，结果如图4所示。在6个批次的丁酸发酵过程中没有明显的滞后期，当新鲜培养基加入后，还原糖在30 h左右就被耗尽，丁酸平均浓度达到25.2 g/L，6个批次中丁酸的得率为0.46 g/g。丁酸的发酵周期平均为32 h。前3个批次周期逐渐缩短，达到稳定。这可能是由于前2个批次纤维床生物反应器上的菌体固定量还没有达到最大，随着批次的增加，菌体密度逐渐增大，生产效率越来越高。利用木薯渣水解液批次发酵产丁酸的最高得率达0.52 g/g，超过了酪丁酸梭菌发酵葡萄糖产丁酸的理论得率0.489 g/g。这可能是由于木薯渣水解液中的蛋白质等其它营养成分也能转化成为丁酸发酵的底物。

图3 以木薯渣水解液为碳源四柱并联固定化反复批次发酵产丁酸动力学

图4 木薯渣水解液批次发酵产丁酸结果比较

以木薯渣水解液为碳源固定化批次发酵产丁酸的终浓度明显高于先前报道的以葡萄糖或木糖[13］为碳源的固定化批次发酵的丁酸终浓度。可能是由于木薯渣水解液中含有一些合成培养基中没有的、有益于促进发酵的天然成分，如生长因子等。

与细胞膜过滤回收发酵相比，该方法解决了发酵的长期稳定性操作问题，避免了膜堵塞和污染问题。同时，使用FBB固定化发酵系统能够消除滞后期，同时能够连续多批次生产丁酸而不用接种新鲜种子液。由于使用FBB固定化发酵系统菌体生长较游离时要少，因此获得了较高的丁酸得率。另外一个可能存在的问题是木薯渣水解液中存在一些较小的不溶的固形颗粒可能会堵塞FBB中纤维织物之间的孔隙，然而经过6个批次的发酵流速和发酵情况没有受到严重的影响。这可能是由于填充材料的孔隙足够让水解液中的细小颗粒通过。

2.3 木薯渣水解液为碳源四柱并联补料发酵产丁酸工艺

补料发酵工艺可以增强丁酸梭菌对丁酸的耐受性。并且通过补料提高发酵液中丁酸的终浓度有利于降低后续分离成本。采用浓缩木薯渣水解液进行丁酸补料发酵的动力学研究。结果如图5所示。

图5 以木薯渣水解液为碳源四柱并联固定化补料发酵产丁酸动力学

每当发酵液中糖的浓度接近于0时，即补入浓缩的木薯渣水解液。随着补料发酵的进行，丁酸浓度不断提高。在发酵到220 h时，丁酸浓度达到61.4 g/L，远高于上述批次发酵中的25.2 g/L。补料初始阶段，丁酸浓度增长较快。在丁酸浓度达到40 g/L后得率和产率下降。这说明，随着发酵液中产物浓度的升高，产物抑制作用变得明显。

使用木薯渣水解液补料发酵产丁酸的总产率略低于以葡萄糖做碳源时四柱并联发酵产丁酸，这可能是产物抑制和木薯渣水解过程产生的有害物质积累共同作用的结果。如果我们对木薯渣水解过程可能产生的糖醛酸、酚类等物质进行分离，将有可能进一步提高其丁酸发酵水平。

3 结论

采用四柱并联纤维床生物反应器固定化酪丁酸梭菌发酵产丁酸的发酵模式是切实可行的。相比于单柱式纤维床生物反应器发酵，其丁酸浓度和产率分别提高7.19%和136.9%。这种模式将有利于解决纤维床生物反应器单纯体积放大时造成的多相传质问题和填充物强度不足等问题。尤其在后续中试及工业化过程中更多纤维床生物反应器并联发酵产丁酸的模式值得继续探索。以木薯渣水解液为碳源进行纤维床生物反应器四柱并联补料发酵，丁酸终浓度达到61.4 g/L。这一结果优于先前报道的采用葡萄糖[12］、玉米芯水解液[4］、废糖蜜[5］为碳源时固定化发酵产丁酸的水平。说明木薯渣水解液是一类既成本低廉，又适合于酪丁酸梭菌固定化发酵产丁酸的优质碳源。

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ABSTRACTAs butyric acid is an important chemical raw material，using cheap non-grain biomass and FBB(fibrous-bed bioreactor)immobilized fermentation to produce butyric acid has important significance.The investigation showed that the four-column parallel immobilized fermentation technology can greatly improve the production efficiency due to the decrease of fermentation recycle to half.In the fermentation with cassava dregs hydrolysate as substrate，25.2 g/L butyric acid was obtained and the yield was 0.46g/g.At last，the production of butyric acid was increased to 61.4g/L through fed-batch fermentation.

Key wordsbrous-bed bioreactor，cassava dregs hydrolysate，butyric acid，fed-batch

Production of Butyric Acid from Casaba Dregs Hydrolysate by Immobilized Clostridium tyrobutyricum in Fibrous-bed Bioreactor

Wang Jin，Cai Jin，Shi Zhou-ming，Huang Lei，Xu Zhi-nan
(Department of Chemical Biological Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China)

硕士研究生(蔡谨教授为通讯作者，E-mail:caij@zju.edu.cn)。

*国家高技术研究发展计划(863计划)(2009AA02Z206)

2012-04-03，改回日期:2012-05-31