许伟，徐为民，郇延军

1(江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京，210014)

2(江南大学食品学院，江苏 无 锡，214122)

发酵条件对香肠中亚硝酸盐和亚硝胺的影响*

许伟1，2，徐为民1，郇延军2

1(江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京，210014)

2(江南大学食品学院，江苏 无 锡，214122)

以发酵香肠为对象，研究了不同亚硝酸盐添加量以及发酵条件下亚硝酸盐残留和二乙基亚硝胺(NDEA)的变化规律。结果表明:各因素对香肠中亚硝酸盐残留和NDEA形成影响的大小顺序为，发酵时间＞亚硝酸盐添加＞发酵温度＞发酵剂。正交实验分析表明:最佳发酵条件为，发酵时间2 d、亚硝酸盐添加量50 mg/kg、发酵温度25℃。

发酵香肠，发酵，亚硝酸盐，亚硝胺

亚硝酸盐是发酵肠制品中常用的食品添加剂，具有发色、抑菌及防腐、抗氧化等多种功能[1］。但研究表明，当一次性摄入过多的亚硝酸盐时，会引起人体的急性中毒反应;此外，亚硝酸盐还能与食品中存在的胺类物质发生亚硝基化反应生成强致癌物质亚硝胺[2］，从而引发一系列食品安全问题。因此在还未找到能完全替代亚硝酸盐物质的前提下，研究亚硝酸盐残留以及亚硝胺形成的变化规律就成为了重点。孙敬等[3-5］从热处理、贮藏的角度研究了肉糜中亚硝酸盐和亚硝胺的变化规律;Rywotycki等[6-7］则研究了原料肉对亚硝胺的影响;此外，Sung[8］还综述了诸如烟熏、烧烤、油炸等不同的烹饪方式对食品中亚硝胺变化的影响。这些研究从不同的角度探究了各种因素对亚硝酸盐残留和亚硝胺形成的影响，然而关于发酵条件的不同对发酵肉制品中亚硝酸盐和亚硝胺变化规律影响的研究还鲜有涉及。因此，本研究以发酵香肠为对象，研究了不同亚硝酸盐添加量和发酵条件下香肠中亚硝酸盐残留和亚硝胺形成的变化规律，并深入分析引起这些变化的原因，从而为掌握发酵肉制品中亚硝酸盐和亚硝胺的变化规律提供理论支撑，并对发酵香肠加工工艺的确定提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

菌种:木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)，均购自广州微生物研究所。

原料:新鲜猪后腿肉购自超市，并于4℃下冰箱贮藏。

试剂:二乙基亚硝胺(NDEA)，Sigma公司，色谱纯;二氯甲烷(应用全玻璃仪器重蒸);其余试剂皆为分析纯。

BS223S型电子天平，上海电子天平厂;CM-14型斩拌机，西班牙MAINCA公司;ZDX-35BI型杀菌锅，上海申安医疗器械厂;恒温水浴锅，郑州长城科工贸有限公司;电子调温电热套，江苏常州市金坛荣华仪器制造有限公司;ZX98-1型旋转蒸发仪，上海鲁伊工贸有限公司;微量进样器(50 μL)，无锡市东升玻璃仪器厂;UV2600型分光光度计，上海天美生化仪器设备工程有限公司;气相色谱-质谱联用仪，美国瓦里安公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵香肠加工工艺流程

原料肉修整(肥瘦质量比2∶8)→切丁→拌馅(加入辅料:食盐、白糖、白酒、亚硝酸盐、五香粉、胡椒粉、味精、淀粉)→腌制→斩拌(加入发酵剂:木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌)→填充→发酵(37℃，48 h)→成熟(65～80℃至表皮干燥呈深红色)→蒸煮(121℃，30 min)→成品

1.2.2 检测方法

亚硝酸盐:GB/T 5009.33-2003盐酸萘乙二胺法[9］;亚硝胺:GB/T 5009.26-2003第二法气相色谱-质谱仪法[10］。

1.2.3 实验设计

考察发酵温度、时间、菌种比例(木糖葡萄球菌接种量:肉葡萄球菌接种量)以及亚硝酸盐添加量4个因素对亚硝酸盐和亚硝胺的影响，分为两部分进行:

首先单独考察各因素对亚硝酸盐和亚硝胺的影响，设计为单因素实验，原发酵条件为:温度37℃，亚硝酸盐添加量150 mg/kg，发酵时间2 d，菌种比例(木糖葡萄球菌接种量比例肉葡萄球菌接种量=1∶1)。各水平选取如表1所示。

表1 因素水平表

单因素实验结束后，按照L9(33)设计正交实验(表2)，综合考察各因素对发酵香肠中亚硝酸盐残留和亚硝胺形成的影响。

表2 正交实验方案

2 结果与分析

2.1 发酵条件对香肠中亚硝酸盐和亚硝胺的影响

由图1可以得出:

(1)低温发酵能促进亚硝酸盐的分解和降低NDEA的形成。关于这点可以从温度对微生物影响的角度进行分析。研究表明某些微生物能促进酶催化的亚硝基化反应[11］，因此本研究认为，这些微生物只有在较低的外界环境中才能得到较好的生长，从而在一定程度上促进亚硝胺的形成。此外，低温也可能有利于能分解亚硝酸盐微生物的生长，从而促进其残留量的下降。

(2)发酵时间的延长能促进亚硝酸盐的分解，这与Marco[12］所得结果一致，这可能是由于亚硝酸盐的活性较大、容易与其他物质发生反应的结果。另一方面，发酵时间还能促进NDEA的形成，这很有可能是其积累所致。

(3)亚硝酸盐在酸性条件下所形成的亚硝基NO+是亚硝化反应的重要底物之一，因此亚硝酸盐作为影响亚硝胺形成的重要因素这一点已得到众多研究者的认可[13-16］，这在本研究中也得到了证实:图1-c)明显的反映出了这一变化趋势。

图1 发酵条件对香肠中亚硝酸盐残留和NDEA形成的影响

(4)本研究所采用的2菌种对亚硝酸盐残留和NDEA的形成没有明显的影响。有研究表明，肠菌属和梭菌属细菌具有合成亚硝胺的能力，而一些细菌能够促进亚硝胺的形成;亚硝胺的合成反应中一些霉菌类会具有生物催化活性，主要包括青霉菌和根霉菌属[17］。因此，本研究所得出的采用木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌(属于葡萄球菌属)作发酵剂时对亚硝胺的形成没有影响这一结论也与上述观点相符。此外，从图1-d还可以看出:相较于空白组，2菌种的添加能降低亚硝酸盐的残留量、但并不明显，这与朱志远[18］所得结果一致。

(5)各因素与亚硝酸盐残留和NDEA形成的相关性分析表明，除了亚硝酸盐添加量，发酵温度和时间对亚硝酸盐残留量的影响皆不显著(P＞0.05);而发酵温度和时间以及亚硝酸盐的添加则均对NDEA的形成有着显著的影响(P＜0.05)。由此可知，仅凭单因素实验还不足以区分各发酵条件对亚硝酸盐和NDEA影响的大小。因此下一阶段在选取一定的因素水平后，采用正交实验的方式来考察发酵温度、发酵时间和亚硝酸盐的添加对这两个变量的影响，以期更准确的把握亚硝酸盐残留和NDEA形成的变化趋势。值得一提的是，由于本研究所采用的两菌种对亚硝酸盐残留和NDEA的形成均没有明显的影响，故在正交实验时将此项排除，不再作为考察因素。

2.2 发酵条件对香肠中亚硝酸盐和亚硝胺影响的进一步探究

根据前一阶段所得实验结果，各因素水平的选取如表3所示。

表3 因素水平表

对于所得实验结果，本研究采用方差分析法分析，计算所得结果如表4所示。

表4 正交实验方案与结果

根据以上计算，进行显著性检验，列出方差分析表，结果见表5。

表5 方差分析表

由表5可知:

(1)所考察的3个因素对亚硝酸盐残留和NDEA形成影响的大小顺序为，发酵时间＞亚硝酸盐添加＞发酵温度。

(2)发酵时间对亚硝酸盐残留和亚硝胺形成的影响都很显著，尤其是对亚硝酸盐的残留，较之亚硝酸盐添加量都明显，表明发酵时间是影响2个观测变量的一个重要因素。

(3)发酵温度对亚硝酸盐残留的影响不大，这可能是因为所采用的发酵剂(木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌)属于过氧化氢酶阳性球菌、能够将亚硝酸盐分解成氨[19］，因此在腌制阶段接入菌种就已经大量增殖、分解了大量的亚硝酸盐，从而导致温度对亚硝酸盐残留影响不大。而对亚硝胺的形成，发酵温度对其影响却较明显，表明低温有利于对亚硝胺的形成起影响作用的微生物的增殖。

(4)亚硝酸盐的添加与亚硝胺的形成呈显著正相关，与其残留有一定的相关性、但并不显著。理论上认为，亚硝酸盐的残留应该与其添加量呈现出较明显的相关性，而本研究结果却表明，两者之间的相关性不显著。关于这一点，本研究认为可以从图2所示来解释——接入发酵剂时，在发酵初期由于只有这两种接入菌种在大量增殖、在其作用下将大量的亚硝酸盐分解、从而导致其残留量增多的幅度不大(F=6.12);然而随着发酵时间的延长(＞2d)、乳酸菌等微生物的增殖会对这两种微生物产生抑制作用[20］，使得亚硝酸盐没有继续被大量的降解、保留了一定的量，从而对亚硝胺的形成没有造成明显的阻碍作用，使得亚硝酸盐添加与亚硝胺形成的相关性显著。

(5)本实验中亚硝酸盐残留量和亚硝胺的形成量皆越低越好。因此综合考虑，发酵时间选择2 d、亚硝酸盐添加量取50 mg/kg、发酵温度选25℃，即优化组合为A2B1C1。当采用此优化最佳发酵条件作试验验证时:对于亚硝酸盐残留量，优化组合A2B1C1平均值为2.456 mg/kg，低于组合A3B3C1的2.578 mg/kg;对于NDEA形成量，优化组合A2B1C1中NDEA均未检出。由此可知:本研究结果与客观事实较符合，满足分析要求。

图2 发酵香肠中微生物的生长(示意图)

3 结论

(1)发酵条件对香肠中亚硝酸盐残留和NDEA形成影响的大小顺序为:发酵时间＞亚硝酸盐添加＞发酵温度＞发酵剂(木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌)。这其中:发酵时间是影响亚硝酸盐残留和NDEA形成的重要因素;亚硝酸盐的添加对NDEA形成的影响也很明显;发酵温度则对NDEA形成的影响较大，对亚硝酸盐残留却没有明显的影响;至于本研究所采用的发酵剂，则对两者没有明显的影响。

(2)本研究所得出的发酵时间2 d、亚硝酸盐添加量50 mg/kg、发酵温度25℃这一优化组合，能有效的降低亚硝酸盐的残留量和抑制NDEA的形成。

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ABSTRACTThe effect of the amount of sodium and fermented conditions on changes of sodium nitrite residues and N-diethylnitrosamine(NDEA)in fermented sausages were studied.The results showed that the effect order of the observed factors on the nitrite residues and the formation of NDEA in fermented sausages were as follows:fermentation time＞addition of nitrite＞fermentation temperature＞starter culture.The optimum fermented conditions fixed by orthogonal experiment were:the fermentation time 2d，the addition of nitrite 50mg/kg and the fermentation temperature 25℃，respectively.

Key wordsfermented sausages，fermentation，nitrite，N-nitrosamine

Effects of Fermented Conditions on Changes of Nitrite and N-nitrosamine in Fermented Sausages

Xu Wei1，2，Xu Wei-min1，Huan Yan-jun2
1(Institute of Agricultural Products Processing，Jiangsu Academy of Agricultural Science，Nanjing 210014，China)
2(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

硕士研究生(徐为民为通讯作者)。

*江苏省农业科技自主创新资金项目(江苏省农业三项工程项目)

2012-04-01，改回日期:2012-06-05