柯仲成，程小玲

1(黄山学院化学化工学院制药工程教研室，安徽 黄 山，245041)

2(屯溪区食品安全办公室，安徽黄山，245000)

枇杷叶总黄酮提取工艺的优化*

柯仲成1，程小玲2

1(黄山学院化学化工学院制药工程教研室，安徽 黄 山，245041)

2(屯溪区食品安全办公室，安徽黄山，245000)

效应面法优化枇杷叶总黄酮的提取工艺。以乙醇浓度、料液比和提取时间为自变量，总黄酮提取率为因变量，通过自变量与因变量的完全二次响应面的回归拟合，用效应面法选取最佳工艺，并进行预测分析。结果表明:适宜的提取工艺是，提取液乙醇的体积分数为73%，料液比1∶11.5(g∶mL)，提取2次，每次140 min。

枇杷叶，效应面法，总黄酮，提取

目前从枇杷叶中分离的有效成分主要有黄酮类、挥发油、三萜酸类、多酚类和有机酸类，其中枇杷叶总黄酮具有明显的抗氧化、延缓衰老的作用[1-4］。目前主要采用正交设计对总黄酮的得取工艺进行考察[5-7］，但该法有许多不足之处，故本文采用星点设计——效应面法[8-9］对提取工艺进行优化。

1 仪器与材料

T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，KQ-100VDE型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，GZX-9146MBE数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，AUY220分析天平(日本岛津有限公司)。

枇杷叶(采自黄山歙县漳潭);芦丁对照品(上海融禾医药科技有限公司，批号:081206)，其他试剂均为分析纯;蒸馏水自制。

2 方法

2.1 总黄酮测定

2.1.1 芦丁对照品的配制

精密称取5.2 mg芦丁对照品于50 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，配成104 μg/mL的芦丁标准品溶液，备用。

2.1.2 样品溶液的配制

取新鲜枇杷叶，烘干，粉碎。称取枇杷叶粉末约10 g于500 mL具塞锥形瓶中，加250 mL体积分数80%乙醇，超声波提取2 h，抽滤，减压回收，浓缩，加沸水溶解，趁热过滤，浓缩，减压干燥，得枇杷叶干浸膏。

精密称取20 mg枇杷叶干浸膏，用甲醇溶解，过滤，并转移至50 mL容量瓶中，定容，即得样品溶液。

2.1.3 波长的选择

精密量取1 mL样品溶液于10 mL容量瓶中，加甲醇至5 mL，加5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min;加10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，再加20%NaOH溶液2 mL，再加甲醇定容至刻度，摇匀，静置15 min。以试剂为空白参比溶液，用紫外可见分光光度计在400～700 nm波长扫描，发现在510 nm波长处有最大吸收峰，故最大吸收波长选定为510 nm。

2.1.4 标准曲线的绘制

分别吸取104 μg/mL的芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至5 mL，分别加入5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀后静置6 min，加10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀后静置6 min，再加入20%NaOH溶液2 mL，甲醇定容至刻度，放置15 min。以试剂为空白参比溶液，在510 nm处测定吸光度。以吸光度Y为纵坐标，浓度X为横坐标，绘制标准曲线。所得的回归方程为Y=0.02081+0.01953X，R=0.99935，表明样品浓度在10.4～52.0 μg/mL内线性关系良好。

2.1.5 回收率试验

精密量取样品液1.00 mL，加入标准芦丁对照品1.00 mL(20.4 μg/mL)，同2.1.2～2.1.4操作测定吸光度，计算得加样回收率为102.8%。

2.2 枇杷叶总黄酮超声提取工艺优化

2.2.1 实验设计及结果

预试验结果显示，枇杷叶回流提取总黄酮的影响因素有:乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数等。考虑提取次数是一个非连续变量因素，处理繁琐，故根据实际情况，将其固定为2。根据星点设计的原理，每因素设3水平，用代码值-1、0、1来表示。代码值所代表的实际操作物理量见表1，实验设计与结果见表2。

表1 试验设计因素与水平的编码与实际值

表2 星点设计与结果表

2.2.2 二项式方程数学模型拟合

利用软件(Design-Expert 7.1.3)将所得的实验数据进行效应面分析，以总黄酮提取率(Y)为效应值，分别对X1、X2、X3三个因素进行二项式方程拟合和多元线性回归，发现用二次阶多项式回归较优，回归方程如下:

删除其中t检验不显著项，将二项式方程方程简化为:

从方差分析结果(见表3)可知，乙醇浓度、液料比、提取时间3个因素对总黄酮提取率都有极显著影响;液料比和乙醇浓度的相互作用具有显著影响。因此，该方程较好的描述了总黄酮提取率随各个因素的变化规律，具有良好的预测指导性。

表3 方差分析表

2.2.3 提取工艺优化和预测

利用Design-Expert 7.1.3软件，参照二次多项式数学模型，绘制总黄酮提取率(Y)与相互作用较显著的2个自变量(X1、X2)的三维效应曲面图及等高曲线，见图1。利用回归模型，可以预测枇杷叶总黄酮提取率的最大值为75.59%，最优提取工艺条件为:11.51倍量的73.38%乙醇，提取2次，每次2.33 h。

2.2.4 验证实验

根据预测的最优提取条件，并为了满足工业化生产方便，将工艺条件调整为11.5倍量的73%乙醇，提取2次，每次140 min，进行验证实验，3次平行实验的总黄酮提取率分别为74.55%、76.13%、75.28%，平均值为75.32%，RSD为1.04%。说明所建立的数学模型具有精确的预测性，所选工艺条件具有良好的重现性。

3 讨论

天然植物中有效成分的提取工艺研究，采用的较多的是正交设计试验。根据参考文献[10］的最佳提取工艺(料液比1∶50，提取温度80℃，提取时间3 h，乙醇浓度50%)，进行了提取预实验，发现总黄酮的平均提取率为71.46%。虽然也可以取得较理想的效果，但由于该方法是采用线性数学模型进行拟合分析，因而无法精确找到最佳工艺。本文采用非线性数学模星点设计-效应面法进行拟合，可以充分考虑了各影响因素之间的交互作用，提高了预测指导性和实验准确性，将更好的促进枇杷叶总黄酮成分的提取以及在保健食品领域的开发利用。

图1 X1X2相互作用对Y的三维效应面和二维等高线曲线图

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ABSTRACTTo optimize the process of extracting effective constituents from Folium eriobotryae by response surface methodology.The independent variables were ethanol concentration，extracting time and solvents ratio.The dependent variable was extracting rate of total flavonoids.Composite design and response surface methods were used to optimize the extracting process，a two-order polynomial equation was fitted，and model was used to predict the response in the optimal region.the optimum conditions of extraction process were:73%%ethanol，140 minutes for reflux，11.5 fold solvent and2times for extraction.The optimum model is highly predictive.

Key wordsfolium eriobotryae，response surface methodology，total flavonoids，extraction

Study on the Process of Optimization Extraction of Total Flavonoids of Folium Eriobotryae

Ke Zhong-cheng1，Cheng Xiao-ling2
1(College of Chemistry and Chemical Engineering ，Huangshan University，Huangshan 245041，China)
2(Tunxi Office of Food Safety ，Huangshan 245041，China)

硕士，讲师。

*黄山学院科研基金资助项目(2007xkjq012)

2012-03-12，改回日期:2012-06-13