张晓萍，段钢

(杰能科(中国)生物工程有限公司，江苏无锡，214028)

高效阴离子交换色谱-脉冲安培法检测低聚异麦芽糖

张晓萍，段钢

(杰能科(中国)生物工程有限公司，江苏无锡，214028)

建立了高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法定量分析低聚异麦芽糖的方法。采用CarboPakTMPA10色谱柱，配合安培检测器，以NaOH及醋酸钠为洗脱剂。采用此方法不仅一次性实现了低聚异麦芽糖常规组分中葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽糖、异麦芽三糖，潘糖的有效分离，也实现了异麦芽四糖、异麦芽五糖、异麦芽六糖、异麦芽七糖、海藻糖、麦芽酮糖、曲二糖、黑曲霉糖高聚合度糖及二糖同分异构体间的分离及检测。以不同浓度的标准糖混合溶液建立了校正曲线，此方法中，各组分在0.032～25.975 mg/L间具有良好的线性关系，各物质的检测限和定量限分别在0.008～0.022 mg/L和0.027～0.073 mg/L，样品加标回收率为82.02%～116.37%。

低聚异麦芽糖，同分异构体，分离，高效阴离子交换色谱-脉冲安培法

低聚异麦芽糖是目前市场上最主要的一种功能性低聚糖，具有难消化性及选择性增殖双歧杆菌及乳酸杆菌从而维持肠道微生态平衡，促进人体健康的功能[1］。低聚异麦芽糖是淀粉经过液化、糖化、转苷等工序制备得到，产品中的有效成分主要指异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖及聚合度大于等于4的糖[2］。在低聚异麦芽糖的酶法制备过程中，由于所使用的转苷酶的作用特性，使得其产物不仅有异麦芽糖、潘糖及异麦芽三糖这些主要的有效成分，还会得到其它的转苷产物，如曲二糖、黑曲霉糖等异构体。由于异麦芽糖、麦芽糖、曲二糖及黑曲霉糖属于2个葡萄糖分子通过不同糖苷键连接所形成的位置异构体，因此它们的结构极其相似，目前常用的分析方法并不能实现这些同分异构体的有效分离。

目前分析低聚异麦芽糖的方法主要是高效液相色谱法，分为只使用氨基键合柱的单柱法和使用离子交换柱和氨基键合柱的双柱法。单柱法中所使用的氨基键合柱能够实现异麦芽糖、麦芽糖、潘糖、麦芽三糖及异麦芽三糖间的分离，但此种类型的色谱柱对聚合度较高的糖具有吸附作用[3］，从而使分析结果不准确。双柱法中首先通过离子交换柱将低聚麦芽糖中的各组分按照聚合度实现分离，再使用氨基键合柱分离同分异构体。双柱法虽然得到的结果准确，但对于聚合度较高的同分异构体也不能实现有效的分离，并且同一个样品需要进行2次分析，分析过程较为繁琐[4］。除了高效液相色谱法，也有毛细管电泳法应用于低聚异麦芽糖分析的报道，毛细管电泳结合激光诱导检测器(CE-LIF)可以实现糖的快速分析，此方法灵敏度高，但属于间接分析法，样品需采用荧光试剂进行衍生化，衍生过程较为繁琐[5］。高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)近年来被广泛地应用于糖类的分析，目前已有应用于分析低聚木糖[6］、低聚果糖的报道[7］及其它糖类的分析[8-9］，但还未有用于低聚异麦芽糖分析的报道。采用此方法分析糖的原理是基于糖是弱电解质，当溶液的pH在11以上，它能够部分或全部以阴离子形式存在，可以吸附在阴离子交换柱上，并被不同浓度的碱溶液洗脱，配合脉冲安培检测器可实现糖类的梯度洗脱及高灵敏度检测[10］。理论上只要被分析的糖存在电离度上的差异，就可以实现分离，因此这种方法非常适合糖的同分异构体间的分离。本文采用CarboPakTMPA10为分析柱，建立了低聚异麦芽糖的HPAEC-PAD定性及定量的分析方法，实现了低聚异麦芽糖中15种组分包括同分异构体之间的一次性分离。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ICS-5000型离子色谱，配备高压泵、柱温箱、安培检测器(Au工作电极，pH-Ag/AgCl参比电极)Chromeleon工作站(美国Dionex)。CarboPakTMPA10色谱柱(250 mm×4 mm)，CarboPakTMPA10保护柱(50 mm×4 mm)(美国Dionex)。Millipore纯水仪(美国millipore)。

葡萄糖，果糖，麦芽糖，麦芽三糖，异麦芽糖，异麦芽三糖，异麦芽四糖，异麦芽五糖，异麦芽六糖，异麦芽七糖，潘糖，海藻糖，麦芽酮糖，曲二糖，黑曲霉糖和50%NaOH试剂，购于Sigma-Aldrich公司。醋酸钠(ICS级)购于Fisher公司。

低聚异麦芽糖浆:配制32%(W/W)底物浓度的麦芽糊精，用稀H2SO4调节pH至5.0。加入大麦β-淀粉酶OPTIMALT BBA(Genencor)和转苷酶TG-L500(Genencor)，酶用量分别为0.2 kg/t(干物)和1 kg/t(干物)。将此反应体系放入60℃水浴中反应40 h。反应结束后，糖液在10000 r/min离心5 min，取上清液稀释后用0.22 μm滤膜过滤，用于色谱分析。

1.2 溶液配制

1.2.1 标准溶液配制

称取一定量的标准样品配制成1 g/L的母液，分装后于-20℃存储。临用前将母液稀释至所需浓度，得到不同浓度的标准样品溶液。

1.2.2 淋洗液

250 mmol/L NaOH溶液:称取20 g 50%NaOH溶液用纯水定容至1 L，轻轻摇匀后立即转入淋洗瓶中通入N2保护(5～8psi)。

500 mmol/L NaOH溶液:称取40 g 50%NaOH溶液用纯水定容至1 L，轻轻摇匀后立即转入淋洗瓶中通入N2保护(5～8psi)。

200 mmol/L NaAc溶液:称取16.4 g NaAc溶解，定容至1 L，摇匀后立即转入淋洗瓶中通入N2保护(5～8psi)。

1.2.3 色谱分析条件

淋洗液A:纯水;淋洗液B:250 mmol/L NaOH溶液;淋洗液C:200 mmol/L醋酸钠溶液;淋洗液D:500 mmol/L NaOH溶液。梯度:0～12 min，22.5～32.5 mmol/L NaOH;12～13 min，32.5～21 mmol/L NaOH;13～31 min，21～90 mmol/L NaOH;31～36 min，90 mmol/L NaOH，0～4 mmol/L NaAc;36～39 min，90 mmol/L NaOH，4 mmol/L NaAc;39～48 min，90 mmol/L NaOH，4～100

mmol/L NaAc;48～52 min，90 mmol/L NaOH，100 mmol/L NaAc;52.1～56 min，200 mmol/L NaOH，4 mmol/L NaAc，56.1～65 min，22.5 mmol/L NaOH。进样方式:手动进样;柱温:30℃;流速:1 mL/min。安培检测器波形:carbohydrate standard quart。

2 结果与讨论

2.1 分析条件的优化

低聚异麦芽糖通常是以淀粉为底物经过液化、糖化和转苷得到，在转苷反应中常使用具有转糖苷作用的α-葡萄糖苷酶。在分析条件的优化过程中发现，除了常规的低聚异麦芽糖组分外，还检测到了海藻糖、麦芽酮糖、曲二糖及黑曲霉糖等其它少量转苷成分的存在。在传统的检测方中，这些少量的转苷成分由于结构相近，不能实现有效分离。而在HPAECPAD的分析过程中只要这些组分在碱性条件下存在电离度的差异，就可以通过调节洗脱液的组成及浓度实现分离。NaOH作为常规洗脱液之一，在糖的分析中扮演着双重角色，既为糖的电离提供碱性环境，同时也是洗脱剂，因此改变NaOH的浓度对于糖的保留时间有较大的影响[11-12］，而NaAc相对于NaOH具有更强的洗脱力。在改变洗脱梯度的过程中发现，对于异麦芽糖和麦芽酮糖的分离，提高NaAC浓度对于二者的影响远大于NaOH浓度的改变，因此要实现二者的基线分离，可将洗脱液中NaAc的浓度降为0，同时提高NaOH的浓度。大幅增加NaOH浓度，可以提高聚合度较高糖的电离能力，增加其与色谱柱的结合能力，改善不同组分之间的分离。通过调节NaOH和NaAc的梯度，实现了低聚异麦芽糖中各组分的分离。在优化了的分析条件下得到了低聚异麦芽糖浆及其标准样品的谱图，见图1。

图1 低聚异麦芽糖色谱图

与HPLC的单柱法和双柱法相比，HPAEC-PAD法可以一次性的实现低聚异麦芽糖中15种组分，包括5种二糖异构体，3种三糖异构体，及聚合度达到7的低聚糖的分离。与CE-LIF法相比可以实现非还原糖(海藻糖)及含有果糖基的二糖(麦芽酮糖)组分分离检测[13］。

2.2 标准曲线和方法检测限

将混合标准样品母液稀释6个不同的浓度，将这6个不同浓度的混合标准液采用已优化的色谱条件进行分离，以浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，得到低聚异麦芽糖中各组分的标准曲线。低聚异麦芽糖各组分在表1所示的浓度内具有线性关系，线性相关系数均在0.9972以上。将低浓度样品逐渐稀释进样直至相应的峰信号为空白样品信噪比的3倍(S/N=3)，得到此方法中各组分的检测限(LOD)，按照3倍检测限确定各组分的定量限(LOQ)。方法的定量限及检测限与HPLC法相比，实现了低聚异麦芽糖的10-6级的高灵敏度检测。

2.3 实际样品分析与精密度测定

采用本文所建立的方法对糊精转苷得到的低聚异麦芽糖进行了测定，并加入2个浓度的各组分进行加标回收实验，结果见表2。加标回收率为82.02%～116.37%，证实此方法具有较高的准确性。加标回收样品测定的标准偏差为0.3%～4.78%。

表2 低聚异麦芽糖各组分加标回收率(n=3)

续表2

3 结论

采用CarboPakTMPA10色谱柱，建立了低聚异麦芽糖的HPAEC-PAD的分析方法。采用此方法实现了低聚异麦芽糖中15种组分，包括5种二糖异构体，3种三糖异构体，及聚合度达到7的低聚糖的一次性分离。通过定量及加标等实验实现了低聚异麦芽糖的定量检测并确定了方法的准确性。低聚异麦芽糖是我国功能性糖产业中非常重要的一种，虽然HPLC法是非常经典的分析低聚异麦芽糖的方法，但HPAEC-PAD法可以更加深入的了解酶在低聚异麦芽糖生产中的作用方式及产品组分，为产品结构的优化提供分析依据。

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ABSTRACTA one-step method for quantitatively determination of isomaltooligosaccharides(IMO)was developed using high performance anion exchange chromatography coupled with pulsed amperometric detection(HPAEC-PAD).The method was built on a CarboPakTMPA10 column using NaOH and NaAC as eluents.Using this method，besides conventional components of isomaltose，isomaltotriose，panose and some saccharides with higher DP were identified from IMO syrup，other transglycosylation saccharides such as trehalose，kojibiose，nigerose and maltulose were also detected from the syrup.Calibration was carried out by dissolving 15 kinds of standard samples containing glucose，fructose，maltose，maltotriose，isomaltose，isomaltotriose，isomaltotetraose，isomaltopentaose，isomaltohexaose，isomaltoheptaose，panose，trehalose，maltulose，kojibiose，and nigerose into a mixed solution.The standard solution was diluted to a calibration range from 0.032 to 25.975 mg/L.The calibration curves showed good linearity of IMO within this range.The detection limits(LODs)and the quatification limits(LQD)were 0.008～0.022 mg/L and 0.027～0.073 mg/L respectively，and the relative standard deviations were 82.02%～116.37%.This method was good and sensitive in the quantitative analysis of IMO.

Key wordsIMO，isomer，separation，HPAEC-PAD

Determination of Isomaltooligosaccharides by High Performance Anion Exchange Chromatography Coupled with Pulsed Amperometric Detection(HPAEC-PAD)

Zhang Xiao-ping，Duan Gang
(Genencor(China)Bio-products Co.，Ltd.，Wuxi 214028，China)

博士(段钢为通讯作者)。

2012-03-20