张学况，杜丽平，王超，杜雨轩，肖冬光

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津，300457)

酶解法增溶酵母(1→3)-β-D-葡聚糖的研究*

张学况，杜丽平，王超，杜雨轩，肖冬光

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津，300457)

以实验室制备的酵母(1→3)-β-D-葡聚糖为原料，通过酶解法制备水溶性酵母(1→3)-β-D-葡聚糖，并对其结构和生物活性进行了研究。以水溶性酵母葡聚糖得率为指标，通过单因素和正交实验，确定了酵母(1→3)-β-D-葡聚糖酶解的工艺条件。优化后的酶解条件为:酶活浓度0.15 U/mL，底物质量浓度0.5 g/100 mL，酶解温度40℃，pH3.5，酶解时间0.5 h，该酶解条件下水溶性酵母葡聚糖得率为80.3%。红外光谱分析表明，水溶性葡聚糖仍具有(1→3)-β-D-葡聚糖分子构型，刚果红实验表明其具有三螺旋结构。活性实验表明，水溶性葡聚糖能有效提高E.coli诱导的患腹膜炎小鼠的存活率。

葡聚糖，酶解法，正交实验，红外光谱，生物活性

酵母(1→3)-β-D-葡聚糖是一种碱不溶性葡聚糖，具有多种免疫刺激活性，能够通过刺激免疫系统对生物反应进行修饰，保护机体免受异物的感染，增强机体的免疫能力，有抗感染、抗肿瘤、抗辐射和促进伤口愈合等功能，是一种重要的生物效应应答剂(biological response modifiers，BRM)[1-4］。因此，酵母葡聚糖在食品、饲料、化妆品和医药等行业具有广泛的应用前景。由于其不溶于水，在应用上受到了很大限制，针对这一问题国内外学者已尝试采用物理、化学和生物修饰的方法对其进行改性增溶。目前国内外对多糖的物理修饰主要是超声解聚，化学修饰主要有氨基化、羧甲基化、磷酸化和硫酸化[5-9］等方法，生物方法主要是通过酶解作用降低多糖的分子量，提高其在水相中的溶解度。Kery[10］等人采用黑曲霉生产的葡聚糖酶对酵母葡聚糖进行水解，但得率不高。本试验以诺维信提供的专一性(1→3)-β-D-葡聚糖酶对酵母(1→3)-β-D-葡聚糖进行水解，考察了酶活浓度、反应温度、时间、底物质量浓度和pH对葡聚糖酶解反应的影响，并对水溶性酵母葡聚糖产品的结构、活性进行了研究，为拓宽酵母葡聚糖的应用范围提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酵母细胞壁，安琪酵母有限公司;大肠杆菌(E-.coli)，工业发酵微生物教育部重点实验室菌种保藏中心;昆明鼠(20 g)，天津奥易责任有限公司;(1→3)-β-D-葡聚糖酶，诺维信(中国)生物技术有限公司;海带多糖，北京鼎国生物技术有限责任公司;其它试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

LD5-10低速离心机，北京医用离心机厂;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限责任公司;ALPHA1-4D真空冷冻干燥机，MARTIN CHRIST;UV—2401PC可见紫外分光光度计，日本岛津;Bruker VECTOR 22傅里叶变换红外光谱仪，德国Bruker。

1.3 实验方法

1.3.1 酵母葡聚糖的制备

称取酵母细胞壁50 g，加入3 g/100 mL NaOH溶液300 mL，75℃恒温水浴3 h，离心收集沉淀。沉淀中加入3 g/100 mL NaOH溶液200 mL，100℃恒温水浴2 h，离心收集沉淀，沉淀加蒸馏水洗涤，无水乙醇洗涤脱水，离心收集沉淀，40℃干燥，即得到不溶性酵母葡聚糖。

1.3.2 酶活力的测定

称取海带多糖10 mg，分散到9 mL的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH5.0)中，50℃水浴10 min。加入1 mL(1→3)-β-D-葡聚糖酶液，50℃恒温水浴反应30 min。取出后沸水浴5 min终止反应，用DNS法[11］测其还原糖质量。酶活力单位的定义:在上述条件下，每分钟能生成1 μmol葡萄糖的酶量为1个酶活力单位。

1.3.3(1→3)-β-D-葡聚糖的酶解

称取0.2 g不溶性酵母葡聚糖分散于9 mL的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，恒温水浴一定时间后加入1 mL(1→3)-β-D-葡聚糖酶溶液进行反应。试验初始条件为:酶活浓度0.1 U/mL，底物质量浓度1 g/100 mL，水浴温度50℃，缓冲液pH4.0，酶解时间2 h。反应结束后沸水浴终止反应，离心(104r/min)取上清液，测定还原糖和总糖。或上清液经浓缩、真空冷冻干燥，制得可溶性酵母葡聚糖样品。

1.3.4 三螺旋结构的测定[12］

配制624 μmol/L的刚果红溶液，不同浓度(0.0025～0.500 mol/L)的NaOH溶液和1 mg/mL的糖液。分别取2 mL不同浓度的NaOH溶液于比色管中，滴加1 mL浓度为1 mg/mL的糖液，28℃作用30 min，然后分别加入浓度为624 μmol/L的刚果红溶液1 mL，28℃作用30 min。UV-2401PC可见紫外分光光度计400～600 nm进行扫描，并记录其最大吸收波长。

1.3.5 红外光谱分析

样品与KBr按质量比1∶150混合，压片，红外扫描，分辨率:4 cm-1，扫描次数:16。

1.3.6 小鼠免疫实验[13］

20只昆明鼠随机分成2组，每组10只。两组小鼠分别腹腔注射浓度为4 mg/mL的可溶性酵母(1→3)-β-D-葡聚糖溶液和葡萄糖溶液1 mL，24 h后再分别给2组小鼠腹腔注射1 mL浓度为109CFU/mL大肠杆菌(E.coli)悬浮液，观察并记录各组小鼠的死亡情况。

1.3.7 酶解液中还原糖质量的测定

DNS法[11］。

1.3.8 酶解液中总糖质量的测定

硫酸-蒽酮法[14］。

1.3.9 水溶性葡聚糖得率的计算

酶解反应结束后，酶解液经灭酶活、离心后，取上清液测定还原糖和总糖质量，计算可溶性多糖得率:

式中:m总为酶解液中总糖质量，g;m还为酶解液中还原糖质量，g;m0为添加酵母葡聚糖的质量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

单因素各水平实验设计见表1，其中每个水平设3个平行，处理时取平均值。实验结果见图1。图1(a)表明还原糖、总糖和可溶性酵母葡聚糖的得率都随着底物质量浓度的增加而减小。这是由于葡聚糖具有强吸水性和持水性，随着底物质量浓度的增大，反应体系粘度不断增大，阻碍了酶与底物的接触。由图1(b)可以看出，不同底物质量浓度下溶液中可溶性多糖的浓度(由于底物质量不同，酶解葡聚糖的得率和质量浓度的变化趋势不同)，在底物质量浓度低于0.5 g/100 mL时，虽然可溶性多糖的得率高，但在溶液中浓度很低，不利于后期提取。因此综合考虑，底物质量浓度应大于0.5 g/100 mL。

表1 单因素实验水平表

由图1(c)可以看出，可溶性葡聚糖得率随着酶活浓度的增大先增大后减小，当酶活浓度为0.1 U/mL时，得率最大可达41.8%。当酶活浓度大于0.1 U/mL时，随着酶活浓度的增大，酶开始作用于已经酶解的葡聚糖，产生大量的二糖、单糖等，导致总糖得率增大的同时还原糖得率也迅速增大，可溶性多糖得率随之降低。

由图1(d)可知，葡聚糖酶的最适温度为45℃，此时总糖、还原糖和可溶性葡聚糖得率均达到最大。可溶性葡聚糖的最大得率为51.9%。

由图1(e)可以看出，总糖和还原糖的得率均随pH升高先增大后减小，酶的最适pH为5.0，此时总糖和还原糖得率均达到最大值，但可溶性葡聚糖得率较低，因此pH5.0不是制备可溶性葡聚糖的最佳pH。可溶性葡聚糖得率随pH的升高在40%上下波动，pH4.0时得率最大为48.7%。在pH4.0～pH5.5时，总糖得率达到最大、趋于平衡，而还原糖得率呈先增后减的趋势。因此，可溶性葡聚糖得率总体呈波动的变化趋势。

由图1(f)可知，可溶性葡聚糖得率随酶解时间的增加先增大后减小，在酶解0.5 h时，其得率最大为51.7%。当酶解0.5 h后，随酶解时间的增加，葡聚糖酶可以充分的作用于经酶解的葡聚糖片段，导致还原糖增加趋势大于总糖增加趋势，因此可溶性葡聚糖得率呈下降趋势。

图1 各因素对可溶性酵母葡聚糖得率的影响

2.2 正交试验结果与分析

为了使酶解反应条件达到最佳，获得最大的可溶性多糖得率，在上述单因素实验结果基础上设计L16(45)正交试验，试验因素水平见表2，结果及极差分析见表3。

表2 正交试验因素水平表

由表3极差分析可知，各因素对酶解葡聚糖得率的影响主次顺序为:酶解温度＞底物质量浓度＞pH＞酶活浓度＞反应时间。最佳工艺条件是A3B1C2D1E1，即酶活浓度为0.15 U/mL，底物质量浓度为0.5 g/100 mL，反应温度40℃，pH3.5，反应时间为0.5 h。在此条件下制备水溶性酵母葡聚糖得率为80.3%，质量浓度为3.6 mg/mL。

表3 正交试验结果与极差分析

2.3 酶解葡聚糖三螺旋结构分析

本实验以刚果红为空白对照，以刚果红-Dextran T-500为无规则卷曲对照，以刚果红-海带多糖为有序的三螺旋结构对照，研究了NaOH浓度对刚果红-酶解多糖最大吸收波长的影响，实验结果见图2。

图2 多糖-刚果红络合物最大吸收波长随NaOH浓度的变化曲线

由图2可以看出，NaOH浓度在0.0025～0.25 mol/L时，刚果红-海带多糖与刚果红-酶解葡聚糖的最大吸收波长维持在495 nm以上。当NaOH浓度大于0.25 mol/L时，刚果红-海带多糖与刚果红-酶解葡聚糖的最大吸收波长迅速向短波方向移动。而刚果红与刚果红-Dextran T-500的最大吸收波长随NaOH浓度的增大而减小。这表明酶解葡聚糖同海带多糖一样具有三螺旋结构，NaOH浓度大于0.25 mol/L后，随着NaOH浓度增加多糖分子间的氢键遭到破坏，使有序的三螺旋结构解旋，导致最大吸收波长向短波方向移动。

2.4 酶解葡聚糖红外图谱

由图3可看出，经酶解制备的水溶性酵母葡聚糖与酶解前的酵母葡聚糖红外光谱图基本一致，在890 cm-1处有明显的β-糖苷键的吸收峰，在2923 cm-1和1370 cm-1处的特征吸收峰表明多糖由β-1，3-D-糖苷键连接，说明其分子构象没有发生变化。

图3 酶解前后酵母葡聚糖的红外光谱图

2.5 酶解葡聚糖对腹膜炎小鼠存活率的影响

由图4可知，注射水溶性酵母葡聚糖的小鼠7 h时开始死亡，10 h时存活率为80%，之后不再死亡，在随后两周的观察中并未发现存活小鼠有任何反常的症状。而注射葡萄糖的小鼠5 h时开始死亡，10 h时全部死亡。这说明腹腔注射水溶性酵母(1→3)-β-D-葡聚糖可以刺激小鼠免疫系统，增强其抵抗E.coli诱导的患腹膜炎的感染，提高小鼠存活时间和存活率，为可溶性酵母葡聚糖应用于医药行业提供依据。

图4 酶解葡聚糖对患腹膜炎小鼠存活率的影响

3 结论

通过单因素试验和正交试验确定(1→3)-β-D-葡聚糖酶对酵母(1→3)-β-D-葡聚糖的最佳酶解条件为:酶活浓度为0.15 U/mL，底物质量浓度为0.5 g/100 mL，反应温度40℃，pH3.5，反应时间为0.5 h。在此条件下水溶性酵母葡聚糖得率为80.3%，在酶解液中的质量浓度为3.6 mg/mL。并通过刚果红实验证明了酶解葡聚糖具有三螺旋结构，通过红外光谱证明了其仍具有β-1，3-D-葡聚糖分子构型。腹腔注射酶解酵母(1→3)-β-D-葡聚糖能有效刺激小鼠免疫系统，提高E.coli诱导的腹膜炎小鼠存活率。

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ABSTRACTThe process of preparation water-soluble yeast(1→3)-β-D-glucan with enzymolysis was studied in this paper.Single-factor test and orthogonal test were conducted to study the influences of various factors on the yield of soluble polysaccharide.The optimal reaction conditions:enzyme concentration 0.15 U/mL，substrate concentration 0.5 g/100mL，reaction temperature 40℃，pH 3.5 and reaction time 0.5 h.The yield of soluble polysaccharide by these conditions is 80.3%.In order to determine the triple helix structure and the molecular configuration of the samples，Congo Red test and FT-IR spectra were used.The soluble polysaccharide by enzymolysis can stimulate the immune system of mice.Not only can it extend the survival time of the mice which was challenged by E.coli，but also can enhance the survival of it.

Key wordsglucan，enzymolysis，orthogonal test，FT-IR spectra，biological activity

An Enzymolysis Method for the Solubilization of Yeast(1→3)-β-D-glucan

Zhang Xue-kuang，Du Li-ping*，Wang Chao，Du Yu-xuan，Xiao Dong-guang
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology Ministry of Education，Tianjin Industrial Microbiology Key Laboratory，College of Biotechnology，Tianjin University of Science＆Technology，Tianjin 300457，China)

硕士研究生(杜丽平教授为通讯作者，E-mail:dlp123@tust.edu.cn)。

*天津科技大学科学研究基金项目(20100208)

2011-11-07