彭英云，张涛，缪铭，沐万孟，江波

1(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)

2(盐城工学院 化 学与生物工程学院，江苏 盐 城，224003)

一株非谷氨酸依赖型聚谷氨酸产生菌的筛选和鉴定*

彭英云1，2，张涛1，缪铭1，沐万孟1，江波1

1(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)

2(盐城工学院 化 学与生物工程学院，江苏 盐 城，224003)

从土壤中分离到1株可不依赖谷氨酸发酵产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的菌株SK19.001，通过16S rDNA序列比对并结合菌株的形态、生理生化特征分析，鉴定此菌株为甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。在以甘油和蛋白胨F403为碳源和氮源的培养基中，37℃振荡培养24 h，γ-PGA产量可达到14.57 g/L。

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)，筛选，鉴定，甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)

γ-聚谷氨酸(Poly γ-Glutamate，γ-PGA)是一种多聚氨基酸类的环保型多功能生物可降解高分子材料，主要由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过酰胺键聚合而成。作为一种高分子聚合物，γ-PGA具有一些独特的物理、化学和生物学特性，如良好的水溶性，超强的吸附性，能彻底被生物降解，无毒无害，可食用等，可作为诸如保水剂、增稠剂、絮凝剂、重金属吸附剂、药物/肥料缓释剂及药物载体等的原料，在农业、食品、医药、化妆品、环保、合成纤维和涂膜等领域具有广泛的应用前景。

γ-PGA多由微生物发酵法得到，主要菌种为地衣芽孢杆菌属和枯草芽孢杆菌属[1］，也有报道从其它菌种如古生菌(archara)[2］、细菌(bacteria)[3］和真核生物(eucaryote)[4］发酵得到。根据细胞生长的营养要求是否需要谷氨酸，可以把γ-PGA产生菌分为两大类:一种为谷氨酸依赖型[5］，如Bacillus licheniformis ATCC9945[6］，B.subtilis IFO3335[7］，B.subtilis F-2-01[8］等，另一种为非谷氨酸依赖型，如B.subtilis TAM-4[9］，B.licheniformis A35[10］。国内学术界对前者的研究较多，有的菌株γ-PGA的产量随着培养基中谷氨酸含量的增加而增加[11］，有的则需要有谷氨酸作为启动因子才会有γ-PGA的产生[12］。而对于非谷氨酸依赖型γ-PGA产生菌报道较少，从工业化角度考虑，筛选非谷氨酸依赖型γ-PGA产生菌株，利用廉价原料生产此种生物可降解高分子材料是非常必要的。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

土壤。

1.1.2 培养基

斜面培养基(g/L):牛肉膏5，蛋白胨5，NaCl，琼脂15，pH7.0～7.2，37℃。

种子培养基(g/L):葡萄糖20，酵母提取粉25，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO41，pH 7.0～7.2，37℃，200 r/min 12 h。

筛选培养基(g/L):种子培养基+琼脂15。

发酵培养基(g/L):葡萄糖15，蛋白胨15，酵母提取粉25，MgSO4·7H2O 0.6，K2HPO41，MnSO41 mmol/L，pH 7.0～7.2，37℃，200 r/min，12 h。

1.2 方法

1.2.1 筛选方法

土壤样品以无菌去离子水浸泡，稀释液涂布于筛选培养基固体平板，37℃培养24 h，观察菌落生长情况，挑选生长快，高黏度的菌落做进一步的筛选分离，将分离到的菌落接种到发酵培养基中，37℃，200 r/min培养24 h，测定发酵液中γ-PGA的含量。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 细胞生长的测定

将培养液稀释20倍后用752分光光度计读取660 nm处吸光值A(660)。

1.2.2.2 发酵液黏度的测定

采用SNB-2数字式黏度仪室温下测定发酵液的黏度。

1.2.2.3 γ-PGA的分离纯化

发酵液适当稀释后以10000 r/min，离心25 min去除菌体，制得发酵上清液，加入2～4倍体积的无水乙醇沉淀聚谷氨酸，轻微搅拌后于4℃静置过夜，将聚谷氨酸沉淀以少量无水乙醇洗涤，用少量去离子水溶解，再次离心去除不溶物，经透析除去盐、糖等小分子，最后冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸。

1.2.2.4 γ-PGA的定性

通过水解液薄层层析法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)分析，将纯化后的聚谷氨酸以6 mol/L HCl，110℃水解24 h，水解液以6 mol/L NaOH中和后以谷氨酸为对照分别用薄层层析法和高效液相色谱法分析其成分。

1.2.2.5 γ-PGA的测定

采用高效液相色谱法(HPLC)分析:将发酵液离心去除菌体后，取一定量以6 mol/L HCl，110℃水解过夜，分别用HPLC测定水解液和发酵液中游离谷氨酸的含量，两者之差即为γ-PGA的产量。

1.2.2.6 菌种的鉴定与保藏

委托武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行鉴定与保藏。

1.2.3 不同碳、氮源对γ-PGA产量的影响

在其它发酵条件相同的情况下，分别选取不同的碳源和氮源进行培养，测定发酵液中γ-PGA的含量，确定SK19.001对碳源和氮源的利用情况。

2 结果与分析

2.1 SK19.001菌株的鉴定

2.1.1 形态特征

通过筛选和分离，从土壤样品中得到1株产γ-聚谷氨酸的高黏菌落，编号为SK19.001，保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏号为CCTCC NO:M2011201)。SK19.001菌株在固体培养基上的生长形态有多样性，当培养基潮湿时，菌落湿润、不透明，表面光滑呈“木耳状”，中心有高黏液滴(图1);干燥时，菌落粗糙皱褶，中央凹陷，边缘不规则。

图1 SK19.001的菌落形态

2.1.2 生理生化特征(表1)

表1 菌株SK19.001生理生化特性

2.1.3 遗传学特征

经过16S rRNA基因序列分析并将序列上传Genbank做BLAST比较(基因登录号为JQ723479)，利用Mega4.1软件构建进化树(图2)，其中同源性最高的为菌株Bacillus methylotrophicus P07(gb|JN700153.1)，同源性为100%，结合生理生化特征，将菌株SK19.001鉴定为甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。

2.2 发酵水解产物的分析

按照1.2.2.4的方法对发酵和发酵水解产物进行TLC分析，以谷氨酸为对照，结果见图3。从图3可以看出，发酵产物水解后主要成分为谷氨酸，进一步通过高效液相色谱分析发现，水解产物出峰单一且出峰时间与谷氨酸一致(图4和图5)，由此可以断定发酵产物为聚谷氨酸。

2.3 对碳源的利用

分别选取葡萄糖、甘油、谷氨酸钠、可溶性淀粉、α-乳糖、麦芽糖、蔗糖、柠檬酸、果糖为碳源，浓度各为30 g/L，其余培养基成分为(g/L):酵母提取粉50、MgSO4·7H2O 0.6、K2HPO41、MnSO41 mmol/L，pH 7.0～7.2，37℃，200 r/min，24 h。结果见表2。

图2 SK19.001菌株的系统发育进化树

图3 发酵水解产物层析图

图4 谷氨酸标样的HPLC图谱

图5 发酵水解产物的HPLC图谱

表2 碳源对SK19.001产γ-PGA的影响

从表2中可以看出，与其它聚谷氨酸产生菌不同的是，甲基营养芽孢杆菌SK19.001可利用的碳源非常广泛，对选取的每种碳源都可利用并产生PGA，说明它是1株可不依赖谷氨酸发酵产聚谷氨酸的菌株，在已经报道的文献中，除了B.subtilis TAM-4[9］，B.licheniformis A35[10］以外，其余产聚谷氨酸的菌株大都需要谷氨酸的存在，如Jung等人[11］对1株Bacillus sp.RKY3的研究表明，培养基如不添加谷氨酸则没有γ-PGA的生成。

2.4 对氮源的利用

分别选取鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白、酵母提取粉、蛋白胨(动物)、蛋白胨F403、玉米浆粉、大豆蛋白胨、NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3、脲素作为氮源，含氮量为5 g/L，其余培养基为(g/L):甘油30，MgSO4·7H2O 0.6，K2HPO41，MnSO41 mmol/L，pH 7.0～7.2，37℃，200 r/min，24 h。结果见表3。

从表3可以看出，甲基营养芽孢杆菌SK19.001主要利用有机氮源产聚谷氨酸，无机氮源几乎不利用，有别于B.subtilis TAM-4[9］、B.subtilis PGA-O-7[13］可利用无机氮源产γ-PGA;在有机氮源中，酵母提取粉、玉米浆粉、蛋白胨(动物)和蛋白胨F403产γ-PGA较高，而不同来源的蛋白胨对SK19.001产γ-PGA的影响较大，表现为对鱼粉蛋白胨几乎不利用;而对动物蛋白胨和蛋白胨F403利用率较高。此外，对γ-PGA黏度的测定表明，发酵液黏度与产量有一定的相关性，即有γ-PGA产生的发酵液都具有一定的黏度，但并不是黏度越高产量越高，有时可能因为发酵液气泡的影响而使得黏度测定值偏高。

表3 氮源对SK19.001产γ-PGA的影响

3 结果与讨论

通过筛选和鉴定，从土壤中得到1株可不依赖谷氨酸发酵产γ-PGA的甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，这是除枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和淀粉液化芽孢杆菌[14］外的1株新的产γ-PGA的芽孢杆菌种属。通过对碳源和氮源的筛选，SK19.001对碳源的利用范围非常广泛，而对氮源则有一定的选择性。

国内外对谷氨酸依赖型菌株研究较多，但从生产原料角度考虑，不需谷氨酸作为发酵底物的菌株具有成本上的优势，更具有工业化应用前景。目前国内对此类菌株的研究还较少，产量也不高(Bacillus subtilis PGA-O-7:2.8 mg/mL[13］;Bacillus licheniformis PGAN:11 mg/mL[15］;Bacillus amyloliquefaciens LL3:4.36 g/L[14］)，SK19.001在碳氮源简单筛选的情况下可产出γ-PGA 14.57 g/L，因此如进一步优化发酵条件，研究代谢过程中各种因素对γ-PGA积累的影响，γ-PGA的产出水平还有较大的提高空间。

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ABSTRACTA strain SK19.001 which could produce poly γ-glutamate(γ-PGA)independent of glutamic acid in culture was isolated.It was identified as Bacillus methylotrophicus based on the sequence analysis of 16S rDNA and a series of morphological and biochemical characteristics.The yield of γ-PGA was 14.57 g/L when the strain was grown in glycerol and peptone F403-containing medium at 37℃for 24 h with shaking.

Key wordspoly γ-glutamate(γ-PGA)，screening，identification，Bacillus methylotrophicus

Screening and Identification of a Glutamate-independent Poly γ-glutamate Produced Strain

Peng Ying-yun1，2，Zhang Tao1，Miao Ming1，Mu Wan-meng1，Jiang Bo1
1(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
2(School of Chemical and Biological Engineering，Yancheng Institute of Technology，Yancheng 224003，China)

在读博士(江波教授为通讯作者)。

*国家自然科学基金项目(20976073，31000764);江苏省国际合作项目(BZ2011026)。

2012-03-20，改回日期:2012-05-22