高健，薛锋，李凤伟，徐虹

1(盐城工学院化学与生物工程学院，江苏盐城，224051)

2(南京工业大学食品与轻工学院、材料化学工程国家重点实验室，江苏南京，210009)

利用絮凝及双水相萃取分离纯化发酵液中的R，R-2，3-丁二醇*

高健1，2，薛锋1，李凤伟1，徐虹2

1(盐城工学院化学与生物工程学院，江苏盐城，224051)

2(南京工业大学食品与轻工学院、材料化学工程国家重点实验室，江苏南京，210009)

针对Paenibacillus polymyxa ZJ-9一步法发酵菊芋菊粉粗提液制备R，R-2，3-丁二醇的发酵液特点，利用壳聚糖对该发酵液进行絮凝研究。结果表明，壳聚糖分子量、壳聚糖用量、助凝剂海藻酸钠用量、pH和搅拌时间分别为:43.5 kDa、0.75 g/L、0.125 g/L、5.0和15 min时，絮凝效果最佳，在此工艺条件下，发酵液中菌体和蛋白质的絮凝率分别高达89.46%和78.93%，而R，R-2，3-丁二醇保留率约为98.54%。利用双水相萃取技术对絮凝后的发酵液中R，R-2，3-丁二醇进行了分离，结果表明，异丙醇/硫酸铵双水相体系萃取效果最好，当异丙醇和硫酸铵的用量分别约为33%和30%(w/w)时，R，R-2，3-丁二醇在上相的分配系数和萃取率最高，分别约为7.96和89.40%，且异丙醇/硫酸铵双水相体系能够有效萃取分离絮凝后的发酵液中不同含量的R，R-2，3-丁二醇。絮凝和双水相萃取技术分离发酵液中R，R-2，3-丁二醇具有针对性强、效率高、成本低等优点，适用于工业化生产。

Paenibacillus polymyxa ZJ-9，R，R-2，3-丁二醇，絮凝，壳聚糖，双水相萃取

2，3-丁二醇是一种典型的生物基化学品，是潜在的重要四碳平台化合物，用途广泛，可应用到食品、燃料、航空航天以及化工等多个领域，用于制备食品添加剂、燃料添加剂、燃料、塑料、炸药、溶剂、油墨、香水、软化剂、增湿剂、熏蒸剂、增塑剂等，具有生物降解性[1-2］。R，R-2，3-丁二醇除了具有2，3-丁二醇的用途外，还是优良的抗冻剂，合成手性试剂和手性配体的重要中间体，在手性药物和天然产物的合成中也有潜在的重要应用[3-7］。

2，3-丁二醇亲水性强、沸点高、黏度大，易于和水发生共沸现象，分离提纯2，3-丁二醇一直成为制约发酵法生产2，3-丁二醇的瓶颈问题。传统的2，3-丁二醇分离方法一般是先采用离心法或膜过滤法对发酵液进行预处理，然后通过有机溶剂萃取、真空膜蒸馏、逆气流提取、盐析等技术进一步浓缩提纯[8-10］。但是离心法、蒸馏法能耗比较大;膜过滤法、有机溶剂萃取法成本高、污染重。而壳聚糖絮凝和双水相体系萃取技术由于具有操作简单、利于放大、环境友好、成本低等优点逐渐成为分离提纯发酵中2，3-丁二醇的研究热点[11-13］。作者在前期研究过程中，筛选获得菌株Paenibacillus polymyxa ZJ-9能一步法发酵菊芋菊粉粗提液高产R，R-2，3-丁二醇，且光学纯度达98%以上[14］。而一步法发酵菊粉粗提液制备R，R-2，3-丁二醇，发酵液中除了含有大量菌体、蛋白质、未消耗的培养基外，还含有多粘类芽孢杆菌合成的大量粘稠性物质以及菊芋菊粉粗提液中残留的纤维素、果胶等，发酵液成分非常复杂，进一步增加了分离纯化发酵液中R，R-2，3-丁二醇难度。本工作首次尝试利用壳聚糖对此类体系进行絮凝研究，然后再用亲水性有机溶剂/盐组成的双水相体系对絮凝后的发酵液进行萃取分离R，R-2，3-丁二醇。

1 材料及方法

1.1 R，R-2，3-丁二醇发酵液制备

在最佳发酵培养条件下，利用菌株P.polymyxa ZJ-9一步法发酵菊粉粗提液合成R，R-2，3-丁二醇，取42 h的发酵液(测定R，R-2，3-丁二醇和菊粉的浓度分别约为37.56 g/L和3.83 g/L)用于分离纯化研究[14］。

1.2 实验方法

1.2.1 絮凝剂的配制

选择脱乙酰度大于90%壳聚糖(分子量约为86.0 kDa)，先用水分散壳聚糖使其终浓度为5%，再加终浓度为5%的HCl溶液水解壳聚糖(每100 mL的5%HCl加1 mL左右的双氧水)，置回流装置分别加热水解15 min、30 min、45 min、60 min、75 min和90 min，水解后将溶液移至旋转蒸发仪，减压蒸发浓缩至粘糊状，加入无水乙醇后用定性滤纸抽滤，沉淀用研钵研磨，加入乙醇重复研磨几遍后，用真空干燥器室温干燥，结果为纤维状或粉末状的固体。检测水解后的壳聚糖分子大小，筛选具有最佳絮凝效果的适宜分子量的壳聚糖水解片段。

采用1.0%的醋酸溶液配制壳聚糖水解片段溶液，并用蒸馏水配制助凝剂海藻酸钠溶液，两者浓度均为10.0 g/L，磁力搅拌溶解后，静置溶胀24 h后备用。

1.2.2 发酵液絮凝单因素实验

用量筒量取40 mL发酵液于50 mL小烧杯中，在磁力搅拌下，向发酵液中逐滴加入适量壳聚糖，然后滴加少量助凝剂海藻酸钠，搅拌数分钟后，静置，取上清液分析菌体及蛋白的絮凝率。从壳聚糖用量、海藻酸钠用量、絮凝pH值和搅拌时间4个因素进行单因素实验研究。

1.2.3 发酵液絮凝正交实验

根据单因素实验的结果，选择壳聚糖用量、海藻酸钠用量、絮凝pH值和搅拌时间4个因素，按照L9(43)进行正交实验(见表1)，以确定最佳的发酵液絮凝工艺条件。

表1 絮凝正交实验因素水平表

1.2.4 双水相萃取实验

取5 mL絮凝后的R，R-2，3-丁二醇发酵液到10 mL的具塞比色管中，分别考察乙醇/磷酸氢二钾、乙醇/硫酸铵、异丙醇/磷酸氢二钾、异丙醇/硫酸铵4个双水相萃取体系对絮凝后的发酵液中的R，R-2，3-丁二醇分离纯化效果。依次加入亲水性有机溶剂、盐，振摇，静置，然后测定R，R-2，3-丁二醇和残糖在双水相体系中的分配系数及萃取率。分配系数K=Ct/Cb，萃取率Y/%=Mt/M×100，去除率R/%=(1-Mt)/M×100，其中Ct、Cb分别为双水相萃取时上、下相中的物质的浓度;Mt、Mb分别为上相物质的量和物质的总量。

1.3 分析方法

1.3.1 发酵液细胞生物量的测定

将发酵液稀释20倍，在660 nm处测定稀释液的吸光值，并将其转换成细胞的干重(DCW)。

1.3.2 R，R-2，3-丁二醇的含量测定

发酵液预处理:取5 mL发酵液到离心管，10000 r/min离心10 min，然后取上清液按1∶1体积比加入乙酸乙酯萃取，静置分层后取上层清液进行气相分析。

检测条件:毛细管手性色谱柱Cyclosil-B，30 m×250 μm×0.5 μm;进样口温度200℃，进样量1.0 μL;分流比20∶1;载气为高纯N2，流速1.2 mL/min;采取程序升温，初始温度130℃，最终温度160℃(维持1 min)，升温速率5℃/min;FID检测器，检测器温度240℃。

1.3.3 菊粉含量检测

菊粉含量检测参照张江红等方法[11］。

1.3.4 蛋白质浓度测定

蛋白质浓度测定采用考马斯亮蓝法[15］。

1.3.5 壳聚糖分子量测定

利用凝胶色谱法测定壳聚糖分子量，以标准分子量的葡聚糖为基准[16］。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖分子质量对R，R-2，3-丁二醇发酵液絮凝效果的影响

分子质量约为86.0 kDa壳聚糖分别经HCl加热水解15 min、30 min、45 min、60 min、75 min和90 min后，测定水解后壳聚糖分子量(kDa)分别约为:72.8、61.2、43.5、28.6、16.9和8.7。分别利用水解后壳聚糖片段及未水解的壳聚糖对R，R-2，3-丁二醇发酵液中的菌体和蛋白进行絮凝。由图1可知，分子量约为43.5 kDa的壳聚糖对发酵液中的菌体和蛋白絮凝效果最好。壳聚糖相对分子质量越大黏度越大，絮凝效率也会越高，但分子质量过大，黏度过高，形成的絮凝颗粒会迅速沉淀，不利于絮凝剂和游离菌体充分作用，反而影响其絮凝效果[16］。但小分子质量的壳聚糖对发酵液中的蛋白质絮凝效果要优于对菌体的絮凝，小分子质量的壳聚糖形成的胶团小，黏度虽低，但相对表面积比较大，能够充分接触比菌体形状小得多的蛋白质，易产生絮凝。

图1 壳聚糖分子质量对絮凝效果的影响

2.2 壳聚糖絮凝最佳工艺条件确定

通过单因素实验对絮凝的工艺条件进行了研究，结果表明，壳聚糖用量、助凝剂海藻酸钠用量、pH和搅拌时间分别为:0.75 g/L、0.125 g/L、5.0和15 min时，絮凝效果相对较好。在上述实验的基础上，采用正交实验确定发酵液絮凝的最佳工艺条件，实验结果见表2。

表2 絮凝正交实验表及结果

经极差分析处理与方差分析，其结果分别见表2和表3。由表可知，发酵液絮凝的影响因素次序为:B﹥A﹥D﹥C，即海藻酸钠用量(B)对絮凝影响最大，其次是壳聚糖用量，相对其它因素，pH值对絮凝效果影响最小。正交实验结果表明，发酵液絮凝的最佳工艺条件为A2B2C2D3。在最佳絮凝工艺条件下，发酵液中菌体和蛋白质的絮凝率分别达89.46%和78.93%。最佳条件絮凝后，R，R-2，3-丁二醇浓度约为37.01 g/L，R，R-2，3-丁二醇保留率高达98.54%。

表3 方差分析表

助凝剂海藻酸钠能够吸附在颗粒表面并起架桥作用，溶液中细小颗粒立即团聚成大颗粒沉淀下来，海藻酸钠用量过多时，使胶团过大，导致快速沉淀，反而不利于发酵液中的游离菌体及蛋白质与壳聚糖充分发生作用，导致絮凝效果偏低。进一步加大壳聚糖用量，对发酵液中的菌体和蛋白质的絮凝效果反而降低，可能是因为发酵液中菌体和蛋白质在壳聚糖表面吸附过多，处于吸附过饱和状态，使形成的胶团重新出现稳定状态，难以絮凝沉淀。搅拌时间过短，絮凝剂不能够和菌体及蛋白质充分接触，导致絮凝不充分;而搅拌时间过长，容易搅碎絮凝形成的胶团，溶液体系再次趋于稳定，难以发生絮凝沉淀，絮凝效果反而不佳。一般情况下，酸性条件有利于壳聚糖对发酵液中的菌体和蛋白质进行絮凝，壳聚糖在酸性条件下发生质子化，呈现阳离子絮凝剂的特征，质子化位点提供架桥的端点，并通过助凝剂的架桥作用促进絮凝发生。过酸的条件易使壳聚糖发生水解，反而不利于架桥作用，阻碍壳聚糖对菌体的絮凝。但是，pH越小越有利于去除蛋白质，这可能是因为溶液过酸容易使蛋白质发生变性作用。

2.3 双水相萃取体系的选择

选择乙醇/硫酸铵、乙醇/磷酸氢二钾、异丙醇/硫酸铵、异丙醇/磷酸氢二钾4个双水相体系为考察对象，取絮凝后的上清液5 mL到具塞比色管中，分别加入2 mL醇后再分别添加浓度(w/w)为15%、20%、25%、30%和35%的盐，充分振摇后静置12 h。结果表明，在盐浓度梯度范围内，乙醇/硫酸铵体系均难以分相;当盐浓度为15%和20%时，乙醇/磷酸氢二钾和异丙醇/磷酸氢二钾体系也不分相，而盐浓度达25%和30%时，上述两种体系上相体积远大于加入的醇的体积，分相效果欠佳;在盐浓度梯度范围内，异丙醇/硫酸铵体系分相效果良好，上相体积与加入的异丙醇体积相当。分析原因，可能是乙醇水化能力比异丙醇强，水分子留在乙醇相中较多，对体系分相不利。王志华等[17］也曾进行过这方面相关研究，发现对于双水相萃取，异丙醇比乙醇效果好，与本文研究结论较一致。由于硫酸铵比磷酸氢二钾更利于体系分相，且价格低廉，因此从考察的4个体系中选定异丙醇/硫酸铵双水相体系对絮凝后发酵液中的R，R-2，3-丁二醇进行分离纯化。

2.4 双水相体系对絮凝后发酵液中R，R-2，3-丁二醇的分离效果

利用异丙醇/硫酸铵双水相体系对絮凝后的发酵液中R，R-2，3-丁二醇进行分离纯化，双水相体系中的异丙醇和硫酸铵的浓度(w/w)能够显著地影响R，R-2，3-丁二醇分离效果，结果如图2和图3。

图2 异丙醇和硫酸铵浓度对R，R-2，3-丁二醇分配系数(k)的影响

图3 异丙醇和硫酸铵浓度对R，R-2，3-丁二醇萃取率(Y)的影响

由图2和图3可知，随着异丙醇浓度的提高，R，R-2，3-丁二醇在上相的分配系数和萃取率逐步增加，但异丙醇的浓度从24%向36%的变化过程中，分配系数和萃取率上升趋势趋于平缓，到33%时萃取率几乎不再改变，而硫酸铵浓度变化对R，R-2，3-丁二醇分离效果的影响，30%浓度明显优于35%及40%浓度。因此，当异丙醇和和硫酸铵的浓度分别为33%和30%时，双水相萃取体系对絮凝后发酵液中R，R-2，3-丁二醇的分离效果最佳，R，R-2，3-丁二醇在上相的分配系数和萃取率分别达7.96和89.40%。上述结果表明，绝大部分R，R-2，3-丁二醇存在于上相异丙醇中。虽然R，R-2，3-丁二醇具有很强的亲水性，但在异丙醇/硫酸铵双水相体系中，由于盐析作用，导致大多数R，R-2，3-丁二醇分配到上相异丙醇中，随着异丙醇浓度的增加，盐析作用不断增强，R，R-2，3-丁二醇在上相的分配系数和萃取率也逐步提高[13］。

异丙醇/硫酸铵双水相体系对絮凝后的发酵液中的菊粉几乎不产生萃取作用，结果如图4所示。由图4可以看出，伴随异丙醇和硫酸铵浓度的增加，絮凝后的发酵液中菊粉在上相的分配系数进一步降低，当异丙醇和硫酸铵的质量浓度分别为33%和30%时，菊粉在上相的分配系数仅为0.038，绝大部分菊粉分配在下相水中，R，R-2，3-丁二醇与菊粉在异丙醇/硫酸铵双水相体系中选择性分离系数高达209.47，该结果表明絮凝后的发酵液中发酵产物R，R-2，3-丁二醇和发酵液中残留的底物菊粉通过异丙醇/硫酸铵双水相萃取能够达到高效分离的效果。

图4 异丙醇和硫酸铵浓度对菊粉分离的影响

2.5 絮凝后发酵液中R，R-2，3-丁二醇含量对分离效果的影响

菌株P.polymyxa ZJ-9一步法发酵菊粉粗提液合成R，R-2，3-丁二醇，不同发酵批次，产物R，R-2，3-丁二醇的产量经常发生变化，特别是补料发酵，产量差异尤为明显。利用异丙醇/硫酸铵双水相体系对絮凝后的发酵液中不同含量的R，R-2，3-丁二醇进行了萃取分离，由表4可以看出，随着发酵液中的R，R-2，3-丁二醇含量的提高，R，R-2，3-丁二醇在上相的分配系数和萃取率也逐步增加，萃取分离效果越来越好，因此，异丙醇/硫酸铵双水相体系非常适合分离纯化絮凝后的发酵液中不同含量的R，R-2，3-丁二醇。在进行双水相萃取时，有趣的是，在上下相之间常形成一个“中间相”，其主要成分是可溶性蛋白质和菌体，由于在双水相体系混合过程中蛋白质发生了不可逆转的变性作用，导致了变性蛋白存在于上、下相之间[18］。由表4可知，异丙醇/硫酸铵双水相体系能够有效地对絮凝后发酵液中残留的菌体、可溶性蛋白质及其它杂质进行进一步去除，大幅度地提高了对发酵液中R，R-2，3-丁二醇分离纯化效果。

发酵液中2，3-丁二醇的传统分离方法主用包含2个过程，先用膜过滤法或离心法去除残留的菌体、蛋白和一些杂质，再用蒸馏法获得2，3-丁二醇[13］，这些方法导致分离纯化丁二醇成本高、效果差。而利用异丙醇/硫酸铵双水相体系对絮凝后发酵液中R，R-2，3-丁二醇进行萃取分离明显优于上述分离效果，菊粉主用存在于下相水中可重复利用，残留菌体和蛋白主用凝聚在“中间相”中容易去除，产物R，R-2，3-丁二醇主要分配在上相异丙醇中，很方便地通过蒸馏进行进一步分离纯化(异丙醇沸点仅为82.5℃)，并且上相中几乎不含菌体和蛋白质量，有效地避免了蒸馏过程中经常发生的粘浆现象[13］。利用双水相萃取分离R，R-2，3-丁二醇，具有效率高、成本低等优点，适用于工业化分离制备R，R-2，3-丁二醇。

表4 发酵液中R，R-2，3-丁二醇含量对分离效果的影响

3 结论

利用壳聚糖对P.polymyxa ZJ-9一步法发酵菊粉粗提液制备R，R-2，3-丁二醇的发酵液进行絮凝，研究发现分子质量为43.5 kDa的壳聚糖对发酵液中的菌体和蛋白絮凝效果最好，并通过单因素实验和正交实验对絮凝的最佳工艺条件进行了研究，结果表明，壳聚糖用量0.75 g/L、助凝剂海藻酸钠用量0.125 g/L、pH 5.0和搅拌时间15 min时，絮凝效果最佳，且海藻酸钠用量对絮凝影响最大，其次是壳聚糖用量，相对其它因素，pH对絮凝效果影响最小。在最佳絮凝工艺条件下，发酵液中菌体和蛋白质的絮凝率分别高达89.46%和78.93%，而R，R-2，3-丁二醇保留率约为98.54%。利用双水相萃取技术对絮凝后的发酵液中R，R-2，3-丁二醇进行了分离，结果表明异丙醇/硫酸铵双水相体系萃取效果最好，当异丙醇和硫酸铵的用量分别约为33%和30%(w/w)时，R，R-2，3-丁二醇在上相的分配系数和萃取率最高，分别为7.96和89.40%，并且异丙醇/硫酸铵双水相体系能够有效萃取分离絮凝后的发酵液中不同含量的R，R-2，3-丁二醇。絮凝和双水相萃取分离纯化发酵液中R，R-2，3-丁二醇具有效率高、成本低等优点，对发酵液中R，R-2，3-丁二醇大规模分离提取应用提供了可靠的技术基础。

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ABSTRACTR，R-2，3-Butanediol(R，R-2，3-BD)can been produced through one-step fermentation of inulin extract from Jerusalem artichoke tubers using Paenibacillus polymyxa ZJ-9.The pretreatment of fermentation broth by chitosan flocculation was investigated.The results were as following:the optimum flocculation was obtained using 0.75 g/L of chitosan with 43.5 ku molecular weight，0.125 g/L of sodium alginate，pH 5.0 and stirring for 15 minutes.The flocculation rate of cells and proteins reached 89.46%and 78.93%，respectively，and the retained ratio of R，R-2，3-butanediol reached 98.54%.Then，the different aqueous two-phase extraction systems were used to further investigate extraction of R，R-2，3-BD from the pretreated fermentation broth and the isopropanol/ammonium sulphate system was chosen as optimum system.The optimum phase composition was 33%(w/w)of isopropanol and 30.0%(w/w)of ammonium sulphate，and the partition coefficient and recovery of R，R-2，3-BD reached 7.96 and 89.40%，respectively.Furthermore，the isopropanol/ammonium sulphate aqueous two-phase extraction system could be used to separate different concentration R，R-2，3-BD from the pretreated fermentation broth by chitosan flocculation.

Key wordsPaenibacillus polymyxa，2，3-butanediol，flocculation，chitosan，aqueous two-phase extraction

Flocculation and Aqueous Two-phase Extraction of R，R-2，3-Butanediol from Fermentation Broth

Gao Jian1，2，Xue Feng1，Li Feng-wei1，Xu Hong2
1(School of Chemical and Biological Engineering，Yancheng Institute of Technology，Yancheng 224051，China)
2(State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Food Science and Light Industry，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China)

博士(徐虹博导为通讯作者)。

*江苏省自然科学基金计划项目(BK2010290);江苏省教育厅高校科研成果产业化推进项目(JHB2011-54);盐城工学院科研基金项目(XKY2009006)。

2012-03-16，改回日期:2012-05-06