王贺，杨瑞金，华霄，赵伟，张文斌

1(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)

2(江南大学食品学院，江苏 无 锡，214122)

利用枯草芽孢衣壳蛋白表面展示β-半乳糖苷酶*

王贺1，杨瑞金2，华霄2，赵伟2，张文斌2

1(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)

2(江南大学食品学院，江苏 无 锡，214122)

分别将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)芽孢衣壳蛋白CotB、CotC、CotG和CotX的启动子和编码序列与来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus IAM11001)的β-半乳糖苷酶基因bgaB进行重组，构建融合表达cotB-bgaB、cotC-bgaB、cotG-bgaB和cotX-bgaB的整合型重组质粒。将4种重组质粒分别转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168(trp-)，获得了能在芽孢表面展示的重组菌株PB701、PB702、PB703和PB704。经Western blot检测，4种重组菌株均表达了预期分子量的融合蛋白，初步表明β-半乳糖苷酶被锚定在重组菌株的芽孢表面。以oNPG为底物测定4种重组菌株芽孢表面展示β-半乳糖苷酶的水解能力，得到的酶活分别为0.14、0.06、0.22和 0 .20 U/mL。

芽孢，表面展示，β-半乳糖苷酶，Western blot

枯草芽孢杆菌属(Bacillus sp.)在营养匮乏、环境恶劣下，其自身的营养细胞会形成一种休眠体，即芽孢[1］。芽孢位于菌体内，由芽孢外壁、芽孢衣壳、皮层和核心构成。芽孢能忍耐一些极端环境如高温、高压、化学药物。枯草芽孢杆菌是GRAS菌种之一，因而它产生的芽孢是安全无毒的[2］。芽孢表面展示技术作为新近发展起来的一门基因操作技术，已引起众多学者广泛关注。相对于其他表面展示技术，它虽起步较晚，但是具有操作简单、稳定性好、安全性高的优点，因而被广泛用于口服疫苗、医药和全细胞催化剂等领域[3］。

实现芽孢表面展示技术的关键是需要一种高丰富度、表面结合能力强的芽孢衣壳蛋白。芽孢衣壳蛋白层一般是由超过50余种的蛋白质构成，分外层和内层。目前，已被成功应用的芽孢衣壳蛋白则都是来源于外层，如CotB、CotC、CotG和CotX[4-7］。从现有的文献报道来看，CotB和CotC常用于锚定抗原制备疫苗，而CotG则锚定酶蛋白发挥全细胞催化剂功能。通过芽孢表面展示技术将功能活性酶展示在芽孢表面作为全细胞催化剂已成当前表面展示技术研究的热点。本研究以β-半乳糖苷酶为目标蛋白，选用CotB、CotC、CotG和CotX四种芽孢衣壳蛋白作为分子载体，将β-半乳糖苷酶展示于芽孢表面，并比较了4种分子载体的展示能力，从而筛选出能够适合展示β-半乳糖苷酶的分子载体。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株、质粒、主要试剂

嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus IAM11001)作为PCR扩增β-半乳糖苷酶基因bgaB的出发菌株。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168(trp-))和大肠杆菌(Escherichia coli Top10)均为本实验室保存，分别作为表达宿主和克隆宿主。携带有红霉素抗性基因的质粒pJS700a由江苏大学宁德刚博士惠赠。高保真Prime STARS HS DNA聚合酶、pMD-19T、各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自宝生物(大连)有限公司;小型质粒提取试剂盒购自北京天泽基因生物科技有限公司;增强型HRP-DAB底物显色试剂盒购自北京天恩根生化科技有限公司;HRP标记的羊抗兔二抗购自Invitrogen-Life technology;兔抗β-半乳糖苷酶血清为实验室前期制备。其他试剂均为国产或者进口分析纯级。

1.1.2 培养基

大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均用LB培养基培养，在需要时分别加入氨苄青霉素(50 μg/mL)和红霉素(10 μg/mL);LB中添加1%淀粉用于筛选枯草转化子;DSM培养基[8］诱导重组菌株产生芽孢。

1.2 cotB、cotC、cotG、cotX和bgaB的扩增

用于扩增4种芽孢衣壳蛋白和bgaB基因的引物设计见表1，其中用于扩增4种芽孢衣壳蛋白基因的下游引物中均不含有终止密码子。

表1 实验中用到的引物

采用上海生工细菌基因组快速提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌的染色体。扩增4种芽孢衣壳蛋白的反应程序如下:95℃5 min，95℃1 min，62℃1 min，72℃1.5 min，35循环。以bgaB-F和bgaB-R为引物、提取的B.stearothermophilus IAM11001基因组DNA为模板，通过PCR反应扩增bgaB。获得的PCR产物经纯化后分别连接于pMD-19T，送上海博尚生物技术有限公司进行测序。

1.3 DNA操作

DNA的酶切、连接和转化大肠杆菌均按照分子克隆标准[9］方法进行。质粒DNA的小量制备、酶切产物回收均按试剂盒方法进行。

1.4 两步法转化枯草芽孢杆菌

采用Spizizen法[10］制备B.subtilis 168感受态细胞，其中SpII中1×CAYE所占的体积比由1%减少到0.1%。转化完毕后涂布在含10 μg/mL红霉素的LB平板，过夜培养后进行筛选鉴定。

1.5 枯草芽孢杆菌的淀粉酶活性分析

从平板上挑取单菌落点接在含1%淀粉的LB平板上，37℃培养12 h以上，喷洒碘液。

1.6 芽孢悬浮液的制备及其芽孢衣壳蛋白的提取

采用DSM培养基作为枯草芽孢杆菌生产芽孢的诱导培养基，具体成分参见文献[8］。按1%接种量(V/V)转接至DSM培养基，37℃培养24 h。收集菌体，分别用1 mol/L的NaCl和KCl洗涤菌体，最后用无菌水悬浮，加入终浓度为5 mg/mL的溶菌酶，于37℃处理2h除去营养细胞，离心去上清。参照SDSDTT法[11］提取芽孢衣壳蛋白。

1.7 Western blot分析

取1mL的芽孢衣壳蛋白溶液，加入等体积的上样缓冲液煮沸5～10 min，离心取上清进行SDSPAGE。蛋白电泳完毕，将分离胶浸在TBST缓冲液中平衡10 min，电转条件:80V，2 h。电转使蛋白质转移到硝酸纤维素膜上(NC)，然后将膜在封闭液中4℃过夜。封闭后，分别加入一抗兔抗β-半乳糖苷酶血清，室温反应2 h，然后加入HRP标记的羊抗兔二抗，最后用增强型的HRP-DAB底物试剂盒进行显色反应。

1.8 β-半乳糖苷酶的酶活测定

以oNPG作为底物，制备的重组芽孢悬浮液为酶液进行反应。取0.8 mL的oNPG溶液(2.5 g/L)于75℃下预热2 min，接着加入0.2 mL芽孢悬浮液进行反应，保温5 min，然后加入1 mL 10%Na2CO3溶液终止反应。分光光度计法测定反应液在420 nm的吸光值OD420，计算产生的oNP的量。酶活单位定义为每分钟产生1 μmol oNP所需要的酶量。

2 结果与分析

2.1 cotB、cotC、cotG 、cotX和bgaB的扩增与融合表达的整合型重组质粒的构建

以B.subtilis 168(trp-)基因组DNA为模板、以cotB-F/cotB-R、cotC-F/cotC-R、cotG-F/cotG-R和cotXF/cotX-R为引物进行PCR扩增4种芽孢衣壳蛋白基因，然后电泳回收PCR产物。以B.stearothermophilus IAM11001基因组DNA为模板和bgaB-F/bgaB-R为引物，扩增得到的产物大小为2.0 kb。上述5个PCR产物纯化后与pMD-19T连接、送样、测序。结果发现，所有序列碱基完全正确。用XbaI/KpnI酶切与pMD-19T连接的4种重组质粒，回收cotB、cotC、cotG和cotX片段，克隆到pJS700a[12］的相应位点，获得的重组质粒分别命名为pJSB、pJSC、pJSG和pJSX。以KpnI/EcoRI双切pMD-19T-bgaB，回收bgaB片段并克隆于上述4个重组质粒的相应位点中，得到质粒pJSBB、pJSCB、pJSGB和pJSXB(图1)。其中每个融合基因的转录都受自身启动子控制。

图1 融合表达cotB-bgaB、cotC-bgaB、cotG-bgaB和cotX-bgaB的整合型重组质粒构建流程图

图2 双酶切重组质粒pJSBB、pJSCB、pJSGB和pJSXB核酸电泳图

2.2 重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的鉴定

采用修改的Spizizen法转化枯草芽孢杆菌。首先以BglII线性化重组质粒，两步法转化B.subtilis 168(trp-)。重组质粒上的整合片段含有部分淀粉酶基因，与宿主菌染色体上的同源片段发生双交换，进而将融合基因整合到染色体上。以含有10 μg/mL红霉素的LB平板进行初筛，然后采用含1%淀粉的LB平板对重组菌进行鉴定，结果见图3。结果显示菌落自身及周围被染成蓝色的转化子，表明其中的淀粉酶因融合基因插入失活，导致不能产生淀粉酶，所以菌落被碘液染成蓝色。而对照菌的菌落及周围则产生透明的淀粉水解圈。表明融合基因已被成功整合到枯草芽孢杆菌的染色体上。4个鉴定后的转化子分别命名为PB701、PB702、PB703、PB704。

图3 重组菌株淀粉酶活性分析。

2.3 Western blot分析表面展示β-半乳糖苷酶重组芽孢

为进一步分析β-半乳糖苷酶是否被锚定在芽孢的表面，以稀释后的兔抗β-半乳糖苷酶血清为一抗，Western blot检测重组菌株的芽孢衣壳蛋白。重组菌经与特异HRP标记的羊抗兔二抗反应后，加入增强型的HRP-DAB的底物试剂盒显色反应，结果见图4。

图4 Western blot分析

从图4看出，在所有重组菌株中都会出现一条在85 ku附近的杂交条带，而空白对照则无任何杂交条带，β-半乳糖苷酶在图上显示了分子量偏低的条带。Western blot结果表明β-半乳糖苷酶利用芽孢衣壳蛋白可以被锚定在芽孢的表面。从图4还可以看出，重组菌株PB702表达的蛋白条带最浅，而重组菌株PB703表达的蛋白条带最深。

2.4 重组菌株芽孢表面展示 β-半乳糖苷酶活性分析

以oNPG为底物对重组菌株PB701、PB702、PB703和PB704芽孢表面展示的β-半乳糖苷酶的活性测定结果如图5。图5显示重组菌株PB702芽孢表面展示的酶活最低，而重组菌株PB703和PB704芽孢表面展示的酶活最高，分别为0.22和0.20 U/mL，表明以芽孢衣壳蛋白CotG和CotX作为分子载体展示β-半乳糖苷酶的效果更好。

图5 枯草芽孢杆菌芽孢表面展示β-半乳糖苷酶的测定结果

3 讨论

由于枯草芽孢杆菌具有较高的安全性和稳定性优点，越来越多的研究人员开始用其展示不同的蛋白或抗原。芽孢表面展示技术的关键是用于锚定的芽孢衣壳蛋白。虽然目前报道的已有3种芽孢衣壳蛋白用作分子载体，但是筛选新的能有效展示外源蛋白的芽孢衣壳蛋白意义仍然十分重大。本文研究了4种不同芽孢衣壳蛋白CotB、CotC、CotG和CotX作为分子载体展示β-半乳糖苷酶并测定了4个重组菌株芽孢表面展示的酶活。结果显示重组菌株PB703芽孢表面展示的酶活最高，其次是重组菌株PB704，而重组菌株PB702则最小，表明CotG和CotX能有效地展示β-半乳糖苷酶。CotB和CotC一般被用来锚定抗原制备疫苗如破伤风毒素TTFC，大肠杆菌的不耐热毒素B亚单位等，而CotG则被广泛用于锚定酶制备全细胞催化剂如ω-转氨酶、N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶等[13-15］。Hinc等人[16］将幽门螺杆菌尿素酶A亚单位(UreA)分别融合到CotB、CotC和CotG上，结果显示CotC最适合UreA的表达，而CotB最适合融合蛋白在芽孢表面的展示。表明使用不同的锚定蛋白对展示的蛋白活性有较大影响，主要与锚定蛋白自身性质有关。李倩等人[7］报道了一种新的芽孢衣壳蛋白(CotX)可以作为分子载体，但未见报道用于固定生物酶。在本研究中发现，CotX可以有效地锚定β-半乳糖苷酶在芽孢表面，而且获得较高的酶活，同时本研究可为其他酶制剂固定提供参考。

[1]Henriques A O，Moran C P Jr.Structure，assembly，and function of the spore surface layers[J］.Annual Review of Microbiology，2007，61:555-588.

[2]Hong H A，Duc L H，Cutting S M.The use of bacterial spore formers as probiotics[J］.FEMS Microbiology Reviews，2005，29(4):813-835.

[3］Wernérus H，St˚ahl S.Biotechnological applications for surface-engineered bacteria[J］.Biotechnology and Applied Biochemistry，2004，40(3):209-228.

[4]Isticato R，Cangiano G，Tran H T，et al.Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores[J］.Journal of Bacteriology，2001，183(21):6294-6301.

[5]Mauriello E M F，Duc L H，Isticato R，et al.Display of heterologous antigens on the Bacillus subtilis spore coat using CotC as a fusion partner[J］.Vaccine，2004，22:1177-1187.

[6]Kwon S J，Jung H，Pan J.Transgalactosylation in a watersolvent biphasic reaction system with β-galactosidase displayed on the surfaces of Bacillus subtilis spores[J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73(7):2251-2256.

[7]李倩，宁德刚，吴春笃.CotX为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示绿色荧光蛋白[J］.生物工程学报，2010，26(2):264-269.

[8]Nicholson W L，Setlow P.In Molecular biological methods for Bacillus[M］.Chichester:John Wiley and Sons Inc.，1990，391-450.

[9]Sambrook J，Russell D W.Molecular cloning:a laboratory manual[M］.3rd ed New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001.

[10]Spizizen J.Transformation of biochemically deficient strain of Bacillus subtilis by deoxyribonucleate[J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1958，44(10):1072-1078.

[11]Cutting S M，Vander-Horn P B.In Molecular biological methods for Bacillus[M］.Chichester:John Wiley andSons Inc，1990:27-74.

[12]Ning D，Leng X，Li Q，et al.Surface-displayed VP28 on Bacillus subtilis spores induce protection against white spot syndrome virus in crayfish by oral administration[J］.Journal ofapplied microbiology，2011，111(6):1327-1336.

[13]Hwang B Y，Kim B G，Kim J H.Bacterial surface display of a co-factor containing enzyme，ω-transaminase from Vibrio fluvialis using the Bacillus subtilis spore display system[J］.Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2011，75(9):1862-1865.

[14]Xu X M，Gao C，Zhang X F，et al.Production of N-Acetyl-D-Neuraminic acid by use of an efficient spore surface display system[J］.Applied and Environmental Microbiology，2011，77(10):3197-3201.

[15]Gao C，Xu X M，Zhang X F，et al.Chemoenzymatic synthesis of N-acetyl-D-neuraminic acid from N-acetyl-D-glucosamine using the spore surface displayed N-acetyl-D-neuraminic acid aldolase[J］.Applied and Environmental Microbiology，2011，77(19):7080-7083.

[16]Hinc K，Isticato R，Dembek M，et al.Expression and display of UreA of Helicobacter acinonychis on the surface of Bacillus subtilis spores[J］.Microbial Cell Factories，2010，9:1-11.

ABSTRACTIn this work，we developed an efficient spore display system that a model protein β-galactosidase was anchored on the spore surface of Bacillus subtilis 168 based on the use of spore coat proteins.The PCR-amplifying cotB，cotC，cotG and cotX were ligated with pMD-19T and digested with XbaI and KpnI，and then subcloned into vector pJS700a previously digested with the same two restriction enzymes，finally resulted in the plasmids pJSB，pJSC，pJSG and pJSX.To construct the gene fusions，the bgaB from Bacillus stearothermophilus IAM11001 was cloned into the KpnI and EcoRI sites of plasmid pJSB，pJSC，pJS G and pJSX to generate generating the plasmids pJSBB，pJSCB，pJSGB and pJSXB，respectively After linearization with BglII restriction endonuclease，the four recombinant integrative plasmids were transformed into B.subtilis 168 to yield the recombinant strain PB701，PB702，PB703 and PB704，respectively.Results from Western blot analysis showed that the fusion protein was immobilized on the spore surface.Using oNPG as substrate，the enzyme activity of spore-displaying β-galactosidase was assayed and they were 0.14，0.06，0.22 and 0.20 U/mL for PB701，PB702，PB703 and PB704，respectively.This result suggested that the fusion proteins could be successfully expressed and located on the spore surface of B.subtilis.

Key wordsspore，surface display，β-galactosidase，Western blot

Functional Display of β-galactosidase on the Spore Surface of Bacillus subtilis Using Spore Coat Protein as Anchor Motif

Wang He1，Yang Rui-jin2，Hua Xiao2，Zhao Wei2，Zhang Wen-bin2
1(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
2(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

博士研究生(杨瑞金教授为通讯作者)

*国家“863”计划项目(2006AA10Z336);江南大学食品科学与技术国家重点实验室目标导向资助项目(SKLF-MB-200804);以乳糖异构化为目标的葡萄糖异构酶定向改造研究(SKLFTS-200903);江南大学博士研究生科学研究基金项目

2012-02-21，改回日期:2012-03-30