银杉根际微生物群落结构初步研究

2012-08-15易思荣韦中强曹厚强

湖南农业科学 2012年19期

易思荣，肖波，黄娅，全健，韩风，韦中强，曹厚强

（重庆市药物种植研究所，重庆 408435）

银杉（Cathaya argyrophylla）是我国特有的第三纪孑遗植物。远在第三纪银杉的家族广布于北半球的欧亚大陆，在第四纪发生的冰川袭击下，银杉才在地球上几乎绝迹，仅在中国亚热带山地的局部地区有零星残存。迄今为止，天然银杉林已在广西、重庆、贵州和湖南4省区发现有分布，基本上间断分布于大娄山、越城岭、八面山和大瑶山，其垂直分布幅度较大，最低分布线为海拔920m，最高分布线达1 840m。但高于1 m的银杉个体总数不超过5 000棵[1]。

银杉起源古老，形态特别，对裸子植物中松科的系统发育和进化的研究，以及古生物、古气候、古地质和古生态方面的研究都有重要的科学价值，被公认为当今世界最珍贵的植物之一，为我国国家一级重点保护野生植物。银杉作为一种濒危植物，自1955年被发现以来，即引起了国内外有关学者的广泛关注和重视，在许多方面的研究都取得了重要进展。近年来，随着对生物多样性保护的高度重视和保护生物学学科的迅速发展，银杉再次受到世人的关注，银杉种群的濒危机制、种群退化和未来命运成为研究热点。本文在了解银杉种群退化的前提条件下致力于对金佛山国家级自然保护区分布的银杉的根际微生物开展初步研究，以期掌握银杉根际微生物的主要类群及其动态变化概况。

1 研究地区概况

金佛山国家级自然保护区位于重庆市南部南川市境内（东经 106°54′～107°27′，北纬 28°46′～29°38′），东接贵州省道真县，南邻贵州省正安县、桐梓县，西连万盛区、綦江县、巴南区，北与涪陵接壤，最高点为风吹岭，海拔2 251 m，最低点在骑龙乡柏林的鱼跳岩，海拔340m，相对高差1 911m，面积约1 300 km2。金佛山属亚热带湿润季风气候区，全年气候温和，四季分明，雨量充沛，既无严寒，又无酷署，立体气候明显。年平均气温8.3℃，极端低温-14.4℃，极端高温29.2℃，年平均降水量1 395.5 mm，平均年日照时数1 079.4 h。平均年≥10℃的活动积温 5 435℃，相对湿度90%。金佛山属贵州大娄山东段的一条支脉，形成于燕山运动后期，其后又受到喜马拉雅造山运动的影响，在长期的内外应力的作用下，形成了深沟峡谷、峭壁悬崖和无数大断层，山体主要由灰岩和石灰岩组成，局部地区分布有玄武岩、页岩、砂岩及变质岩等，主要土壤类型有黄壤、黄棕壤及少量亚高山草甸土[2-4]。

金佛山属于中国－日本森林植物亚区的华中地区，位于我国三大特有现象中心之一的鄂西—川东植物分布中心，从地理位置分析，它不仅位于东西植物分布的交界地带，也处于南北植物分界的边缘地区，是众多野生植物的自然分化中心或分布中心[5-6]；另外由于金佛山处于亚热带湿润气候区，长期受太平洋湿润季风气候的影响，生物气候条件十分优越，再加之第四纪冰川运动时受到的影响很小，使部分亚热带珍稀濒危植物得到保存、繁衍和发展，故区内植物种类繁多，类型复杂多样，形态特征各异，不同地质年代的植物和不同区系成分的植物常常混合在一个植物群落里，珍稀、孑遗植物也相当丰富，是我国不可多得的中亚热带植物集中分布中心。

2 材料与方法

2.1 样品采集

根据金佛山自然保护区内银杉分布区的地形地貌、海拔高度、自然植被等特征，选择6处有代表性的取样点设立标准样地。在各标准样地内选择标准木3株，在标准木下挖出表层（0～20 cm）细根（<5 mm），作为获取根际土壤的材料，同时按S形在各标准样地内布点（3～5点），取0～20 cm非根际土壤。将采集的土样放入已消毒的纸袋，封口并放入消毒密闭的塑料袋，带回实验室立即进行检测和微生物的分离培养。采样时间分别为3月13日、6月20日、9月18日和12月17日。

2.2 样品处理

称取一定量的银杉根条，置于装有定量无菌水的容器中，振荡15～20min，洗下的土壤溶液即为根际土壤悬液。用无菌镊子取出银杉根条，用滤纸吸干表面水分称重，即可计算出根际土壤的重量。称取一定量的非根际土，置于装有定量无菌水的容器中，振荡15～20 min制成非根际土悬液。从野外采集回来未能及时处理的土壤样品保存于4℃冰箱中。

2.3 土壤pH值和含水量测定

将采集回来的土样与水按照一定的比例混合后用精密pH计测定土壤pH值。称取定量的新鲜土壤置于金属容器称量，在恒温烘箱中烘干至恒重后称重，计算土壤含水量。

2.4 菌株的分离和培养

采用稀释平板法分别测定不同取样点银杉根际土悬液和非根际土悬液的细菌、真菌和放线菌数量。真菌采用PSA培养基，细菌采用NA培养基，放线菌采用改良高氏1号培养基。各土壤溶液分别取100μL置于PDA培养基平板中央，并使用无菌玻璃棒均匀涂布，然后在不同条件下培养。细菌置于37℃恒温培养箱中培养3～4 d后计数，真菌置于28℃恒温培养箱中培养3～4 d后计数，放线菌置于28℃恒温培养箱中培养6～7 d后计数。再将获得的菌株进行分离、纯化和编号，并接种于相应培养基中继续培养，置于4℃条件下保存，用于分类鉴定。

2.5 土壤微生物种群数量测定与分类鉴定

细菌、放线菌和真菌的活菌计数培养基分别为牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、孟加拉红琼脂培养基，具体培养方法见参考文献[7]，并采用CFU（Colony Forming Unit）法进行计数。优势菌株的分类鉴定遵循以生理生化特征为主，以形态结构、菌落特征为辅的原则，依据经典的分类方法[8-10]进行。

3 结果与分析

3.1 土壤pH值和含水量检测

不同季节采集回来的土样需要及时进行检测，将其与水按照1:5的比例混合后用精密pH计测定土壤的pH值。另称取各新鲜土样10.0 g放入金属容器中称重，再置于恒温烘箱中烘干至恒重后称重，计算出土壤含水量。结果表明春、夏、秋、冬四季银杉林地土壤的pH值分别为6.74、6.93、7.03和6.83，土壤的含水量分别为 16.33%、12.23%、10.76%和14.56%。

3.2 根际微生物数量和组成

经过培养分离和鉴定，银杉根际微生物中细菌、放线菌及真菌的数量分别细菌7.35×105cfu/g、放线菌 7.65×104cfu/g、真菌 1.11×104cfu/g，分别占根际微生物总量的89.35%、9.30%和1.35%，其中细菌的数量最多，放线菌次之，真菌的数量最少，与其他物种的根际微生物的分布规律相符合。表明细菌在促进土壤C、N、P等元素的转化及维持生态平衡等方面发挥主导作用。

3.3 细菌的初步鉴定结果

从不同季节的银杉根际土壤中分离到的细菌总计4个属，共计14株。其中，芽孢杆菌属（Bacillus）8 株、假单胞菌属（Pseudomonas）3株、微球菌属（Micrococcus）2株、土壤杆菌属（Agrobacterium）1株，分别占细菌总株数的57.14%、21.43%、14.29%和7.14%。土壤中芽孢型细菌的主要类群有巨大芽孢杆菌（B.megaterium）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、蜡质芽孢杆菌（B.cereus）等。

3.4 放线菌的初步鉴定结果

从不同季节的银杉根际土壤中分离到的放线菌分属2个属，共计12株。其中，链霉菌属（Streptomyces）菌株有8株，分属3个种，即微白链霉菌（S.albidus）4 株、绿黄链霉菌（S.viridoflavus）3 株、灰色链霉菌（S.griseus）1株，链霉菌属占总株数的92.31%；诺卡氏菌属（Nocardia）有1株，为绿色诺卡氏菌（N.viridis），诺卡氏菌属占总株数的7.69%。

3.5 真菌的初步鉴定结果

从秋季樟子松根际土壤中分离到的真菌分属3个属，共计10株。其中青霉属（Penicillium）有5株，木霉属（Trichoderma）3株，毛霉属（Mucor）有 2株，分别占分离到的真菌总菌株数的50%、30%和20%。

4 小结与讨论

4.1 主要结果

通过对不同季节采集回来的银杉根际土样分析检测，春、夏、秋、冬四季银杉林地土壤的pH值分别为6.74、6.93、7.03和6.83，土壤的含水量分别为16.33%、12.23%、10.76%和14.56%。

通过对银杉根际微生物的分离培养和鉴定，银杉的根际微生物中细菌、放线菌及真菌的数量分别细菌 7.35×105cfu/g、放线菌 7.65×104cfu/g、真菌1.11×104cfu/g，分别占根际微生物总量的89.35%、9.30%和1.35%。

其中细菌总计4个属，包括芽孢杆菌属、假单胞菌属、微球菌属和土壤杆菌属，放线菌有链霉菌属和诺卡氏菌属，真菌有青霉属、木霉属和毛霉属。

4.2 前期研究结果

前期研究中，针对银杉的根际微生物研究报道极少，仅邢树堂等[11]报道了银杉外生菌根的观察方法，且试验材料为银杉的种子，随后赵颖茹[12]对广西花坪自然保护区的两株银杉开展了根际土壤真菌的分离与鉴定，而其他研究中主要集中于群落结构与生长发育规律等方面[1,13-15]。

韩艳洁[16]对内蒙古大青山的几种乔木树种人工林的根际微生物的数量和动态分布情况予以了报道，结果表明人工油松林、人工落叶松林和天然次生白桦山杨林的根际微生物的数量等级均达到了107cfu/g以上；高明华等[17]从樟子松根际土壤中分离到细菌6属、放线菌2属、真菌3属，研究结果表明各类群根际微生物数量均有明显的季节变化。其他针对松科植物根际微生物的研究未见报道。

4.3 讨论

研究结果表明银杉根际微生物中细菌在数量基本上比放线菌和真菌高1个数量级，说明在微生物总体数量上细菌占绝对优势，银杉的根际微生物在数量上至少较其他松科植物低1～2个数量级，同时不论从类群数量还是个体数量上，银杉的根际微生物总量都不及其他松科植物丰富。

前期研究结果表明，细菌有利于促进土壤中有机残体的分解和潜在养分的转化，提高土壤的供肥能力，释放出的CO2可供植物进行光合作用[18]。根际微生物种类和数量越大，土壤微生物的活性越强，越能促进植物的生长。另外土壤中的细菌产生的挥发性物质能影响其他土壤微生物的生长，从而直接影响了土壤微生物的群落结构[19]。由此笔者推测目前各地普遍存在的银杉种群退化、个体生长缓慢、种子自然萌发率低和成苗率低等现象，极有可能与银杉的根际微生物群落结构密切相关，因此有必要在这方面开展更加深入的研究。

[1] 谢宗强，李庆梅.濒危植物银杉种子特性的研究[J].植物生态学报，2000，24（1）：82-86.

[2] 四川植被协作组.四川植被[M].成都：四川人民出版社，1980.

[3] 四川盆地陆相中生代地层古生物编写组.四川盆地陆相中生代地层古生物[M].成都：四川人民出版社，1982.

[4] 吴征镒，王荷生.中国自然地理—植物地理（上册）[M].北京：科学出版社，1983.

[5] 郝日明.试论中国种子植物特有属的分布区类型[J].植物分类学报，1997，35（6）：500-510.

[6] 易思荣，黄娅.金佛山自然保护区种子植物区系初步研究[J].西北植物学报，2004，24（1）：83-89.

[7] 李振高，骆永明，滕应.土壤与环境微生物研究法[M].北京：科学出版社，2008.71-94.

[8] 王大耜.细菌分类基础[M].北京：科学出版社，1977.

[9] 瓦克斯曼.放线菌[M].北京：中国环境出版社，1987.

[10] 中国科学院微生物研究所.常见与常用真菌[M].北京：科学出版社，1978.

[11] 邢树堂，李玉花，瓦里奥·禄敏.银杉外生菌根形态观察法探讨[J].北华大学学报（自然科学版），2005，6（4）：348-351.

[12] 赵颖茹，苟小军，颜军.两株银杉根际土壤真菌的分离与分子鉴定[J].成都大学学报（自然科学版），2009，28（2）：94-98.