张 涛，卫恒习，李 莉，梁 杰，张守全

（华南农业大学动物科学学院，广州 510642）

高繁殖力一直是畜牧工作者追求的目标，在养猪业尤显其重要，因为配种和妊娠相关的生产成本与窝产仔数有关。因此，提高猪群繁殖力是提高猪场经济效益的重要手段。人工授精技术在规模化猪场的广泛应用后，公猪在整个生产环节中的重要性越来越明显[1]，如何准确地评估公猪的繁殖性能和受精能力，淘汰繁殖力较低的公猪是降低养猪效益的重要因素。可见，准确评定公猪精液受精能力是提高猪场生产水平关键之一。

不同的公猪和其精液的受精能力具有差异，目前，在生产上人们检查公猪精液品质仍采用观察精子活率、精子密度、精子畸形率等常规指标[2], 这些评估参数和公猪受精能力有部分的相关性，其中以精子活率较准确，但它是质量指标而不是数量指标，即它可将精液区分为“好”或“坏”2种[3]。但也有一些研究者人为，虽然这些数据很重要，但是不能准确判断雄性个体的繁殖能力，生产实际中，一些公猪精液的上述评定指标皆正常，但配种或输精后却有较多的发情正常的母猪返情[4]；不少猪场约有5%～8%母猪窝产仔数仅3～5头，使猪群的窝均产仔数下降（内部资料）。可见，这些常规评估方法不能客观评价公猪精液受精能力，而仅仅是检查精液品质的优劣。因此，虽然这些常规评定方法已经得到广泛利用，但是由于这些传统精液品质鉴定方法的局限性，还不能够准确预测健康公猪的精液是否达到了正常工业生产标准。

对相关公畜受精能力因素的功能性和分子机制的研究发现，这些影响受精能力的因素可区分为可补偿和不可补偿因素[5]。可补偿因素是能够通过增加授精剂量的方式克服的，而不可补偿因素是不能够通过增加授精量来克服的性状。在生产中，常常利用提高输精剂量，和广泛运用的混合精液来掩盖了相关公猪低受精能力的影响，以期提高母猪繁殖性能。由于不同精液之间精子受精能力存在差异，通过混合精液（混合精液指2 头或2 头以上公猪精液混合后输精）的方法，达到提高母猪分娩率和产仔数的目的，也可提高精液处理的效率。但有时2 头公猪精液混合后，受精能力可能降低，这可通过观察混合后精液的活力是否下降进行判断，且出现这一现象比例较低[6]。现在很多证据显示，生产中有些公猪的精液常规品质鉴定正常，然而其受精能力和繁殖性状表现较差，虽然采用混合精液可以掩盖这部分公猪的受精能力的缺陷，但需要加大输精剂量。采用提高授精剂量和采用混合精液输精的方式来掩盖相关公猪受精能力低的影响，不仅造成了生产成本的浪费，还影响了高水平公猪精液的有效利用。如果能有效地淘汰这些低受精能力的公猪，就可以提高公猪利用效率，减少公猪饲养成本，提高猪肉生产效率。

当前的精子质量的评定方式常常不能有效地预测公猪的繁殖和受精性能，所以，就需要发展一些具有准确性和预测性的评定方法，能够准确地评定公猪受精能力和淘汰繁殖效率低下的公猪。最近的一些研究显示，在其他家畜上运用的一些生物标记能够准确评估公畜受精能力和淘汰低繁殖性能较差公畜，在公猪上也有相关的研究报道，本文主要是对受精能力相关精清蛋白、精子附着蛋白和受精能力相关遗传因素作为潜在的受精能力的生物标记综述。

1 精清蛋白

精清是精液的重要组成部分，主要是由雄性附性腺和附睾分泌的，含有一些特殊的有机和无机的影响精子质量的成分，在精子获能和受精过程中扮演着重要角色，同时也保护了精子免受损伤和维持精子寿命的作用。随着研究的深入，人们希望在精清中寻找某些成份作为判定动物精液受精能力的指标。例如，牛精清中胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)可增加精子活率、精清中血小板激活因子(PAF)和血小板。激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)、牛精清中脂类和抗氧化物、牛精清中肝素结合蛋白、猪精清蛋白(PSP)可调节子宫内免疫力、异种动物精清蛋白对绵羊精子有影响、狨精液中促受精多肽[8]、猪精清中精子黏合素AWN-1、猪精清中透明带结合蛋白、猪精清中精子活率抑制因子(SMIF)、猪精清中顶体素抑制因子[9]、肝磷脂结合蛋白(HBP)在附睾的精液中含量很少但在体外的精液中含量较高、肝磷脂结合蛋白在预冷冻阶段可以促使胆固醇的释放提高精液的活力。对公猪精清蛋白质的分析[10]，发现了一些重要的精清蛋白，包括骨桥蛋白(osteopontin 55 ku)；及一类精子黏附素家族蛋白包括：猪精清蛋白PSP, 精清精子黏合素AWN-1, AQN。

1993年，Killian等[11]用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，首次发现牛精清中存在与精液受精能力相关的4种蛋白，2种精清蛋白(seminal protein, SP)SP26（26 ku，pI 6.6）、SP55(55 ku, pI 4.5)含量高，精液受精能力高，相关系数达0.89。SP26、SP55含量在高受精能力牛精液中分别是低受精能力精液的3.5倍和2.6倍,称“受精能力”蛋白（fertility proteins）；另外2种精清蛋白（16 ku,pI 4.1和16 ku,pI 6.7）含量高，牛精液受精能力低，称“抗受精能力”蛋白（antifertility proteins）。不同采精频率，公牛精清中SP26含量不同，连续几次采精后，检测不到精清中SP26的存在。进一步研究发现牛精清中SP55为糖基化蛋白，而不是磷酸化蛋白；牛精清中SP26被确定为脂类促成素型PGD合酶(lipocalin-Type prostaglandin D synthase)，也存在于脑脊髓中；在人精液中也发现类似SP26的物质（27 ku）存在。Flowers[12]首次在猪精液中发现“受精能力”蛋白SP26、SP55，但未对这2种蛋白进行准确定量测定，也未发现“抗受精能力”蛋白，以SP26、SP55含量相对高的公猪精液和含量相对低的公猪精液等精子数混合输精，90%(45/50)的仔猪为前者的后代，因该试验未说明输精所用精液的精清来源，且试验数据较少，尚缺乏说服力。猪精清中SP26、SP55影响猪精液受精能力的作用机理的研究尚未见报道，该领域的深入研究，以猪精清中SP26、SP55含量作为指标准确评定猪精液受精能力将成为可能。

精清黏附素家族蛋白在精子成熟过程中包裹在精子表面，引起精子表面膜结构发生变化，进而影响精卵融合，精子黏附素被认为有利于维持精子质膜的稳定性，调节精子-输卵管相互作用[13]，精子获能和精-卵相互作用。对公猪精清中PSP-1进行分离和鉴定，发现它可能具有阻止精子提前成熟和顶体反应的作用，也有报道发现它还具有免疫调节的活性。另一个重要的精子黏附素AWN-1，主要是在睾丸网、前列腺、精囊腺和雌性生殖道中合成，可能会影响精子与透明带附着的活性，对于精子的获能有相关作用。

考虑这些精清蛋白能否作为受精能力相关的标记物时，需要采用常规精液品质分析正常公猪的精液，为了消除剂量补偿作用，在实验中常把输精剂量降低到15亿个/头份，然后结合每头公猪的繁殖指数进行分析，以此来确定这些特殊蛋白与受精能力之间的关系。Novak(2011)等人通过对受精能力高和受精能力低的公猪群进行精清蛋白分析，发现蛋白PSP-Ⅰ（22-ku）与总产仔数和稀释精液7 d活力负相关，以前一些研究也发现PSP蛋白与精子的寿命有关，但是Novak(2011)等人发现如果精清中此蛋白过量或精子暴露其中时间过长有可能会造成受精能力降低；同时还发现了一个25 ku的抗氧化酶（GPX-5），被认为有保护精子膜免受氧化损伤，可能与妊娠率和繁殖指数正相关。鉴于精清中这些特殊蛋白的重要作用，可以进行其更深入的研究，使之成为公猪受精能力和繁殖性能的标记物。

2 精子附着蛋白

由于一个卵子只和一个精子结合，所以在输入的大量精子中只有少量的精子参与受精并形成胚胎，对于一个卵子的成功受精需要很适宜和有序的条件。从精子形成到成功受精的过程中，需要各种适宜的环境，这就涉及到许多生物因素的参与。就目前对于公猪繁殖力的生物标记的研究，主要是集中在精清中特殊蛋白质的分析，同时对于一些影响精子形成和在受精过程中发挥重要作用的蛋白质也引起了越来越多的关注。在公马上，鉴定出4个精子膜蛋白与繁殖力有关，包括：SNARE 蛋白, Caveolin-1, NSF和柠檬酸合成酶；在公牛上也发现了精子附着类DNA酶Ⅰ与公牛高繁殖能力相关，以及OPN定位于精子膜上，也与公牛的繁殖力有关。对繁殖性能高和低的公牛精子提取物分析发现，蛋白CCT5和CCT8、ELSPBP1、BSP1、AK1、PEBP1蛋白的含量有显著的差异。目前对于精子附着类蛋白质作为公猪受精能力标记的报道还比较少，这需要进一步探索。

3 遗传因素

一直以来，由于繁殖性状的遗传力较低，一般不会作为遗传育种的参考性状。生产中常常采用的是通过杂交和人为的环境控制来提高种畜的繁殖性能。在猪生产中，也是采用杂交技术和繁殖技术提高种猪的繁殖性能。目前，随着分子生物和基因组测序技术的快速发展，利用相关的遗传信息，找出一些准确和有预见性的基因组标记物，能有效地评估公畜繁殖力。在公马上，编码富含半胱氨酸的分泌蛋白3 (CRISP3) 的编码基因上具有单核苷酸多态，CRISP3在精清中大量表达，实验证明它与低受精能力有关，同时也报道了抑制素βA（INHBA）的单核苷酸多态与妊娠率有关。在猪上，目前对于与公猪受精能力相关的遗传因素也有一些报道。Lin等人(2006）[14]对可能影响公猪受精能力相关的基因进行检查，结果发现GnRH受体（GnRHR）与MOT、PDR、ASR有明显的正相关性，抑制素βA（INHBA）与原生质滴和畸形率有明显关联，抑制素βB（INHBB与精子密度有较强的相关性。CD9分子在公猪的附睾中表达，对精子的发育成熟有相关作用，CD9基因的第6内含子上存在一个SNP，其多态性与精子的畸形率、活力和原生质滴率有明显的相关性。雌激素在雄性动物血液中含量很低，但是在精液中的含量却较高，雌激素受体主要是ESR1和ESR2，其中ESR1在输精管、附睾中大量表达，在输精管中主要参与离子转运和液体重吸收的过程，在附睾中主要是维持渗透压和pH的作用。缺乏ESR1的雄性个体表现繁殖力严重受损，说明它对雄性生殖性能有重要的影响，对公猪ESR1基因检测后发现，ESR1基因上存在2个SNP，位于外显子1上单核苷酸多态与精子活力和原生质滴残留率有关，位于内含子1上非编码区的单核苷酸多态则与受胎率有关。目前在公猪上对于与受精能力相关的SNP的研究还较少，也不够深入。现在的大规模测序技术，需要检测群体足够大，并且检测费用较多，这些可能是限制其更深入研究的因素。

遗传信息作为受精能力标记是一个比较有前景的方法，目前的高通量测序技术对于大规模的SNP检测有很大帮助，可能会促进公猪受精能力相关SNP的研究。但是这就需要收集大量公猪的DNA和SNP基因型信息，只有这样才能有效的确定公猪繁殖力在基因组上的标记。

虽然这些已有的蛋白质和基因组标记与公猪繁殖力有相关性，但是由于其重复性和实践运用的限制，通过这些标记鉴定公猪繁殖力高低还是远远不够的。只有借助于结合大规模已有公猪群繁殖性能指数，获得相关的回归模型和简单准确的检测方法，才能发现更准确和更具预测性的生物标记。总之，相信不久的将来，人们将会借助生物标记，建立简单高效评定方法，可在生产中准确评估个体公猪的受精能力的高低。

[1] 张守全.美国猪人工授精技术应用现状及启示[J].黑龙江动物繁殖,1998,6(2):41-44.

[2] 张守全.猪人工授精技术基本原理和做法[J].广东养猪业,1998(4)：32-36.

[3] Flowers W L.Management of boars for efficient semen production[J].Repro Fert Suppl，1997,52:67-78.

[4] 张守全.应配未配后备母猪的激素诱情配种试验[J].养猪,1999(1):24.

[5] Foxcroft G R, Dyck M K, Ruiz-Sanchez A,et al.Identifying useable semen[J].Theriogenology，2008,70:1324-1336.

[6] 张守全.猪人工授精[J].养猪，2007(3):17-20.

[7] Yang W C, Kwok S C M,Leshin S, et al. Purified porcine seminal plasma protein enhances in vitro immune activities of porcine peripheral lymphocytes[J].Biol Repro，1998,59:202-207.

[8] Kennedy A M, Morrell J M, Siviter R J,et al.Fertilization-promoting peptide in reproductive tissues and semen of the male mermoset[J].Mol Repro Dev, 1997,47:113-119.

[9] Kwok S C M, Dai G, McMurtry J P.Molecular cloning and sequence analysis of the cDNA encoding porcine acrosin inhibitor[J].DNA and Cell Biol,1994,13(4):389-394.

[10] Strzezek J, Wysocki P, Kordan W,et al. Proteomics of boar seminal plasma current studies and possibility of their application in biotechnology of animal reproduction[J]. Reprod Biol,2005(5):279-290.

[11] Killian G J,Chapman D A,Rogowski L A.Fertility-associated proteins in Holstein bull seminal plasma[J]. Biol Repro，1993，49(6):1202-1207.

[12] Flowers W L. New ideas on boar and sow fertility examined[J].Feedstuffs，1998,24:12-23.

[13] Liberda J, Manaskova P,Prelovska L,et al. Saccharidemediated interactions of boar sperm surface proteins with components of the porcine oviduct[J].Reprod Immunol，2006，71:112-125.

[14] Lin C L, Ponsuksili S, Tholen E,et al.Candidate gene markers for sperm quality and fertility of boar[J].Animal Reproduction Science，2006，92:349-363.