张冬杰，刘 娣，汪 亮，别 墅，杨国伟

（黑龙江省农业科学院，哈尔滨 150086）

冷诱导RNA结合蛋白（Cold inducible RNA-binding protein，CIRP）是在哺乳动物细胞中发现的首种冷应激或冷休克蛋白，伴随冷应激过程过量表达[1]。日本Nishiyama实验室首次从小鼠睾丸细胞中分离到冷诱导RNA结合蛋白，发现温和冷处理（29～22℃）可显著提高小鼠CIRP mRNA水平，相反热处理（39和42℃）则降低其表达水平 。日本Saito实验室研究证实牛蛙脑中CIRP在冬季强烈表达，而在夏季表达量很低。这表明CIRP表达可能在动物冬眠过程中发挥一定作用[3]。日本Aoki实验室和Nishiyama实验室分别证实CIRP具有RNA分子伴侣活性[4]。英国Banks实验室在发育的非洲爪蟾神经组织内发现该基因瞬时表达，这表明在神经发生过程中发挥重要作用[5]。我国从2005年对CIRP进行研究。李安民实验室报道CIRP在脑缺血时表达及亚低温下冷诱导CIRPmRNA在大鼠脑内的表达情况[6]；杨焕民实验室克隆BALB/C鼠睾丸组织中CIRP，并制备与鉴定CIRP多克隆抗体[7]。为进一步探讨CIRP基因在猪上的生物学功能，本研究克隆民猪的CIRP基因mRNA序列，对该基因在不同组织的表达水平进行了检测，并分析冷诱导下该基因的表达变化情况。

1 材料与方法

1.1 材料

75日龄民猪3窝共计12头，将每窝个体随机分成2组即常温组和低温组，每组各6头，购自黑龙江省农科院畜牧研究所。2009年12月25日到2010年1月6日期间，将常温组置于正常舍内饲养，温度控制在（10±2）℃，低温组在舍外半敞式大棚内饲养，温度为（-20±3）℃，两组均饲喂相同的饲料。处理结束后，屠宰，取腿部肌肉组织各10 g，以液氮保存带回实验室，-80℃冰箱冻存。

感受态细胞(购自北京原平皓生物技术有限公司)；rTaq酶、限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ、T 载体、TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver3.0(购自TaKaRa公司)；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒（购自天根生化科技有限公司）；SYBR Green PCR Master Mix（购自美国ABI公司）；TRIZOL（购自Invitrogen公司）。

1.2 方法

1.2.1 民猪CIRP基因的克隆

以GenBank上已公布的人CIRP基因序列（NM_001280）为源序列，使用BLAST在线软件进行相似序列搜索，找到一条猪的完整EST序列（AK235139），经反复比对后，初步认定为该EST序列即为猪的CIRP基因序列，据此共设计2对引物进行CDS全长序列的扩增，引物序列如下：CIRP1F： 5'GCCGTTGTGCTGTGCTGTCT 3'， CIRP2R：5'TAGTCCCTGGAGCCGCCATA 3'，预计扩增长度510 bp左右；CIRP3F：5'GCTCCAGGGACTACTA CAGC 3'，CIRP4R：5'CCTTAGCCACTTCAAATA CAACAT 3'，预计扩增长度800 bp。PCR扩增结束后使用胶回收试剂盒回收目的片段，连入T载体后，转化入大肠杆菌，过夜培养后，摇菌提质粒，送交北京华大生物公司测序。

1.2.2 生物信息学分析

用DNAMAN6.0和DNAStar7.0软件对所测得序列进行拼接和分析；用ProtParam tool软件进行氨基酸组成、等电点分析；利用用NCBI的Conserved Domains程序对蛋白的保守结构域进行预测；使用TMpred和TMHMM对蛋白质进行跨膜区分析；利用NetPhos 2.0 Server和NetPhosK 1.0 Server软件对蛋白质进行磷酸化位点的预测。

1.2.3 冷诱导后CIRP基因的表达变化

将常温组和低温组个体肌肉的cDNA分别混合，获得2个cDNA池，分别记为常温组和低温组。设计1对特异性引物用以Real-time PCR检测，选择β-actin基因作为看家基因，引物序列如下 ： CIRP5F： 5'TGTTCCTGAGCGTAGCAT 3'，CIRP6R： 5'TCCTTAGCCACTTCAAATA 3'， actinF：5'CGGGACCTGACCGACTACCT 3'，actinR：5'GG GCCGTGATCTCCTTCTG 3'。分别以这2个cDNA池为模板，采用二步法进行Real-time PCR扩增。反应体系如下：上、下游引物各0.8 μL，Mix 10 μL，模板0.8 μL，H2O 7.6 μL，共计20 μL。反应程序如下：95℃10 min，95℃30 sec，60℃1 min，40个循环。反应结束后，获得每个样本的Ct值，使用如下换算公式进行目的基因最终的相对定量结果：2-△△ct，其中ΔΔCt=（Ct,目的基因－Ct,管家基因）实验组－（Ct,目的基因－Ct,管家基因）对照组。

2 结果与分析

2.1 民猪CIRP基因序列分析

克隆测序获得了民猪CIRP基因的3个转录变异体，转录变异发生在编码区内。CIRP变异体1基因cDNA长1 278 bp（GenBank登录号：HQ 908794），其中包括93 bp的5'UTR区，519 bp完整的CDS编码区以及666 bp的3'UTR区，编码172个氨基酸，终止密码子为TAA。ORF由113个腺嘌呤（A）、191个鸟嘌呤（G）、98个胸腺嘧啶（T）和117个胞嘧啶（C）组成，四种碱基的含量依次为21.77%、36.80%、18.88%和22.55%，G、C（59.36%）含量高于A、T（40.65%）含量。

CIRP变异体2基因cDNA长1 653 bp（GenBank登录号：HQ908795），与变异体1相比，在其编码区的第501碱基处，出现了一段375 bp的插入片段，该插入片段的第46～48个碱基为TAG，使翻译提前终止，共编码182个氨基酸。ORF由115个腺嘌呤（A）、207个鸟嘌呤（G）、105个胸腺嘧啶（T）和122个胞嘧啶（C）组成，四种碱基的含量依次为20.95%、37.70%、19.13%和22.22%，G、C（59.92%）含量高于A、T（40.08%）含量。

CIRP变异体3长1 765 bp（GenBank登录号：HQ908796），与变异体2相比，在其编码区的第428碱基处，出现了一段115 bp的插入片段，该插入片段的第5～7个碱基为TGA，使翻译提前终止，共编码144个氨基酸。ORF由91个腺嘌呤（A）、164个鸟嘌呤（G）、86个胸腺嘧啶（T）和94个胞嘧啶（C）组成，四种碱基的含量依次为20.92%、37.70%、19.77%和21.61%，G、C（59.31%）含量高于A、T（40.69%）含量。3种转录变异体的核苷酸和氨基酸序列比对结果见图1和图2。

用NCBI的Conserved Domains程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测该蛋白的保守区域，结果发现在该基因的氨基端具有1个高度保守的RNA结合域（RNA recognition motif）。该保守区域由73个氨基酸组成（第7到第80位氨基酸），其中包含2个高度保守序列，分别为1个氨基酸六聚体（序列为LFVGGL，位置：第8到第13位氨基酸）和1个氨基酸八聚体（序列为RDFGFVTF，位置：第47到第54位氨基酸），其他一些疏水性氨基酸掺杂在这些保守序列中。使用TMpred（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）和 TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在线软件分析，CIRP不存在跨膜结构域，初步认为冷诱导RNA结合蛋白应是一种存在于细胞质中的蛋白质。NetPhos 2.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测 CIRP 三种转录蛋白的磷酸化位点结果如表1所示。使用在线软件NetPhosK 1.0 Server预测特异蛋白激酶的磷酸化位点，临界值设为0.6，预测结果显示，变异体1存在7个特异蛋白激酶的磷酸化位点（3个PKA，1个PKB，3个PKC），变异体2存在7个特异蛋白激酶的磷酸化位点（2个PKA，1个PKB，4个PKC），变异体3存在4个特异蛋白激酶的磷酸化位点（2个PKA，1个PKB，1个PKC）。

表1 NetPhos 2.0 Server软件预测CIRP蛋白的磷酸化位点Table 1 Prediction phosphorylation sites of CIRP protein by NetPhos 2.0 Server

2.2 冷诱导后CIRP基因表达变化结果

将常温组民猪的CIRP基因mRNA表达量设定为1，以相对表达水平的差异倍数为纵坐标，测得3个重复的CIRP基因mRNA动态表达水平见图3。t-test结果显示民猪的CIRP基因的mRNA水平经冷诱导后出现了显著的上升（P＜0.05）。

图3 冷诱导后CIRP基因表达变化结果Fig.3 Expression of CIRP gene after cold-induced

3 讨论与结论

温度降低可以降低组织器官的代谢率，并且对心、脑、肝脏等主要脏器功能有明显的保护作用，这种保护作用很可能是通过冷休克蛋白（Cold shock proteins,CSPs）在低温条件下的高表达来实现的，但具体是通过何种途径产生保护作用的机理目前仍不清楚，高等生物中CIRP和RBM3是研究相对较多的CSPs。CIRP广泛存在于植物、人类、小鼠、大鼠、非洲爪蟾、牛蛙、鲑鱼等生物体内，在神经系统发育、胚胎发育等许多进化过程中发挥重要的作用。但到目前为止，还没有见到关于猪的CIRP基因的相关报道。因此本研究以人的CIRP基因序列为源序列，BLAST比对后发现了一条已公布的完整的猪的EST序列，但按照此序列进行克隆测序后，竟发现3个转录变异体，它们在5'端高度保守，但在3'端出现较大变异，而且由于插入序列的存在，使得变异体2和变异体3均出现转录提前终止情况。这与Fageeh等在鼠上的研究结果略有不同[8]，他们在扩增鼠的CIRP基因5'-UTR区时发现3个转录本，由于转录本长度的不同造成转录起始位点的改变，进而产生了3个转录变异体，而且3个转录变异体在不同温度下NIH-3T3细胞系的稳定性和活性均存在差异，据此推测CIRP表达受到不同长度的mRNA所调控。

冷应激对活体生物基因表达的影响少见报道，和细胞相比生物体具有更加复杂的冷应激调节机制，冷应激会对动物的生产性能[9]、免疫[10]、神经内分泌系统[11]均产生不同程度影响。已报道的关于温度变化对CIRP基因的表达影响结果基本一致，即高温会对该基因的表达产生抑制作用[12]，而低温则可明显地诱导该基因的表达。本研究结果与前人的研究结果一致，即对民猪低温冷处理后，肌肉中CIRPmRNA的表达水平出现显著上升。“冷应激会上调CIRP基因的表达”这一结论已基本得到证实，但其上调表达的作用机理以及生物学意义仍是目前研究的热点。有人认为CIRP可能是通过激活细胞外信号调节激酶（Extracellular signalregulated kinase，ERK）信号通路来保护细胞免受低温伤害[12]。

本研究克隆获得了民猪CIRP基因的3种变异体，3种转录变异体的核苷酸序列同源性为86.45%，氨基酸序列同源性为87%。冷诱导后，CIRP基因在肌肉中的表达水平出现显著升高（P＜0.05）。

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