程 军 张 雯 程擎天 羊淑敏 杭州市红十字会医院肾内科 杭州 310003

系统性红斑狼疮（SLE）是一种累及多系统、多器官的自身免疫性疾病，其主要临床表现除皮疹外，尚有肾、肝、心等器官损害，且常伴有发热、关节疼痛等全身症状。肾脏是SLE重要的损伤的靶器官之一，从病理检查发现90%以上的SLE患者中有肾脏受损。狼疮性肾炎导致终末期肾功能衰竭是SLE患者致死的重要原因之一。因此进一步深入研究SLE及其狼疮性肾炎的免疫发病机制很有必要。近年研究发现，自身免疫性疾病与γδT细胞密切相关[1]。作为SLE重要损伤部位的的肾脏，γδT细胞在狼疮性肾炎中发病地位目前尚不清楚。本研究观察了γδT细胞在系统性红斑狼疮小鼠外周血、肾组织的分布情况，并检测了γδT细胞分泌转化生长因子（TGF-β1）功能，现报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 模型组小鼠15只，12周龄，雌性，体质量30～37 g，MRL/Lpr系自发性系统性红斑狼疮模型小鼠（SPF级），购自中国科学院上海药物研究所实验动物中心。正常对照组小鼠10只，BALB/C，由浙江中医药大学基础医学院动物中心提供，均为雌性，10周龄，体质量19～21 g。均在浙江大学医学院动物实验中心饲养适应1周，实验室通风良好，室温24℃，自然昼夜循环，非直接光照条件下生活，小鼠进食饮水自由。

1.2 药物与试剂 RPMI 1640培养液、抗核抗体试剂，抗小鼠TCRγδ单克隆抗体、抗小鼠TCRγδ-FITC（上海晶美公司）、重组小鼠IL-2细胞因子（邦定生物医学公司）、小鼠TGF-β1 ELISA试剂盒、24孔培养板、胎牛血清（杭州四季青生物公司）；尿蛋白试纸为广州市花都高尔宝生物技术有限公司产品。荧光显微镜为日本 Olympas产品。流式细胞仪（FACSCa li bur）为美国 BECTON DICKINSON产品。

2 实验方法

2.1 抗核抗体检测 采用间接免疫荧光法，按试剂盒说明操作。荧光二抗为FI TC标记山羊抗小鼠IgG，于荧光显微镜下观察结果。

2.2 尿蛋白检测 用尿蛋白试纸蘸取小鼠尿液，与标准尿液分析试纸条的颜色，并进行比较，结果以-、+、++、+++表示。

2.3 尿蛋白定量检测 通过考马斯亮蓝法检测小鼠24h尿蛋白定量，免疫荧光法检测肾组织IgA的沉积情况。于实验第10周末，注射完SEB后，用代谢笼收集小鼠24 h尿液，记录尿量，用考马斯亮蓝法测定尿蛋白浓度，计算24 h尿蛋白排泄量（具体方法参照试剂说明书进行）。

2.4 SLE小鼠外周血、肾组织、脾脏γδT细胞比率测定

2.4.1 肾皮质中淋巴细胞制备 取一小块肾皮质，通过直径250 μm滤网制成单细胞悬液，并用PBS冲洗收集滤过细胞，再以1 500 r/min离心10 min，收集的细胞重新悬浮在含40%Percoll的1640液中，然后取上述细胞悬液缓慢覆盖在含66.7%的Percoll溶液上，以2 100 r/min室温条件下离心20 min。分离细胞以PBS液反复洗涤，备用。

2.4.2 脾脏中淋巴细胞的制备 取一小块脾脏组织，通过直径250 μm滤网制成单细胞悬液，并用PBS冲洗收集滤过细胞，用生理盐水对倍稀释后加入Ficoll上，以2 200 r/min离心30 min分离单个核细胞（PBMC），再依次以 1 500 r/min、1 000 r/min、800 r/min离心10 min洗涤，计数后备用。

2.4.3 外周血PBMC的制备 无菌抽取小鼠静脉血3 mL置于肝素抗凝管中，用生理盐水对倍稀释后加入Ficoll上，以2 200 r/min离心30 min分离PBMC，再依次以 1 500 r/min、1 000 r/min、800 r/min 离心10 min洗涤，计数后备用。

2.4.4 肾脏、外周血、脾脏中γδT细胞比率检测 取含1×105个分离的淋巴细胞悬液，以含10 g/L BSA的PBS液重悬后，加入抗小鼠TCRγδmAb-FITC，室温静置30 min。用10 g/L多聚甲醛固定后，用流式细胞仪检测γδT细胞的阳性率。阴性对照为FITC标记的正常IgG类型。

2.5 肾组织、脾脏中γδT细胞的扩增及鉴定 按照我们已经建立的方法[2]，将含1 mg/L抗 TCRγδmAb的无血清RPMI1640培养液加入到24孔培养板内，于37℃包被2 h。洗板后，加入1×106/mL个前述方法获得的淋巴细胞，再加入含10%的胎牛血清和200U/mL rIL-2的RPMI1640培养基，于37℃ 5%CO2孵箱中培养，每2～4天反复吹打培养液，并吸取总数为2×106个细胞分孔扩大培养。根据细胞的生长情况加入含血清和200U/mL rIL-2的RPMI1640培养基，培养2周后即可建立培养体系，每7天、14天取培养细胞以流式细胞仪检测γδT细胞的比率，方法同前。

2.6 TGF-β1检测 细胞培养实验体系的建立:分别将脾脏、肾组织γδT细胞按1×106个γδT细胞/孔加入RPMI1640培养基24孔培养板中，分别加入抗小鼠CD3 mAb（终浓度1μg/L），每孔液量1 mL。5%CO2、37℃条件下培养 48 h。1 000 r/m 离心，收获孔内上清，分装留测细胞因子TGF-β1，方法为ELISA，按照说明书操作。

3 实验结果

3.1 抗核抗体检测 SLE模型组抗核抗体滴度为1：320～1：1 000；正常对照组全部为阴性。

3.2 小鼠尿蛋白检测 模型组中6只+，9只++。正常对照组尿蛋白均为阴性。

3.3 24 h尿蛋白定量测定 模型组高于正常对照组（P＜0.05），见表1。

表1 两组小鼠24h尿蛋白定量比较（±s）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05

24h尿蛋白定量/mg 0.62±0.46 7.05±1.72△组 别正常对照组SLE模型组n/只10 15

3.4 外周血γδT细胞比率 模型小鼠外周血γδT细胞比率明显高于正常对照组（P＜0.05），见表2。

表2 两组小鼠外周血γδT细胞比率比较（±s）

表2 两组小鼠外周血γδT细胞比率比较（±s）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05

γδT细胞/%4.65±2.35 19.88±7.47△组 别正常对照组SLE模型组n/只10 15

3.5 SLE小鼠肾组织、脾脏γδT细胞比率 正常小鼠肾组织未发现有γδT细胞浸润，SLE小鼠肾组织有γδT细胞的浸润；正常组及SLE模型组小鼠脾脏中可检测到γδT细胞，但明显低于肾组织（P＜0.05），见表3。

表3 两组小鼠肾组织和脾脏γδT细胞比率比较（±s）

表3 两组小鼠肾组织和脾脏γδT细胞比率比较（±s）

注：与模型组肾组织比较，△P＜0.05

γδT 细胞/%1.65±0.67△1.92±0.64△11.69±5.47组 别正常组脾脏SLE模型组脾脏SLE模型组肾组织n/只10 15 15

3.6 小鼠肾组织与脾脏组织γδT细胞分泌TGF-β1水平 SLE模型小鼠肾组织γδT细胞分泌TGF－β1水平明显高于正常组和SLE模型组脾脏中γδT细胞（P＜0.05），见表4。

表4 两组小鼠TGF－β1水平比较（±s） pg/mL

表4 两组小鼠TGF－β1水平比较（±s） pg/mL

注：与模型组肾组织比较，△P＜0.05

TGF－β1 41.50±19.43△47.30±25.15△112.80±34.19组 别正常组小鼠脾脏SLE模型组脾脏SLE模型组肾组织n/只10 15 15

3.7 相关性分析 SLE小鼠肾组织中γδT细胞分泌TGF－β1水平与蛋白尿水平呈负相关（r=-0.34，P＜0.05）。

4 讨论

SLE是一种常见多因性自身免疫病,病因和发病机制尚未完全阐明。其中MRL/Lpr小鼠是常用的SLE动物模型之一[3]，其症状与人类SLE相似,包括显著的血清自身抗体、免疫复合物肾小球肾炎，血管炎等。本实验结果和文献报道一致，MRL/Lpr小鼠出现蛋白尿，抗核抗体滴度达到 1：320～1：1 000，肾脏损伤出现蛋白尿,表明实验所用的MRL/lpr小鼠全部处于发病状态。

SLE的发病与T细胞的病变密切相关，调控产生自身抗体的自身反应性T细胞有αβT细胞和γδT细胞，目前研究主要集中在αβT细胞，对于γδT细胞研究较少。研究显示，γδT细胞在SLE的发病中起着重要作用。Peng[4]研究发现，缺乏γδT细胞的小鼠表现为严重的SLE病变及肾脏损害，并认为γδT细胞具有部分调节性T细胞免疫功能，可以调节αβT细胞辅助B细胞产生自身抗体功能，从而对SLE具有保护作用。Fujii等[5]研究发现，体外γδT能抑制TB细胞协同产生抗体。Robak等[6]研究发现，虽然SLE患者外周血γδT细胞下降，但SLE患者的皮肤可见γδT明显增高，其可变区基因重排表现为限制性取用，其中Vdelta2 TCR+与Vgamma9 TCR+显著增高，并与SLE患者活动性密切正相关性。

调节性 T 细胞（regulatory tcells，tregs）是 T 细胞的一个亚群，能通过影响其它免疫细胞的活性来发挥抑制免疫应答的功能。近年来，调节性T细胞成为免疫学领域的一个研究热点。经典的CD4+CD25+的功能已经基本明了，CD4+CD25-T细胞在体外经过TGF-β1的诱导可以转变为CD4+CD25+Treg，并且高表达Treg的特异性标记物FoxP3[7]。γδT细胞虽然只占总T细胞的一小部分，但其独特的抗原识别模式使得γδT细胞在免疫系统中发挥着重要的作用。近年研究表明，γδT细胞无论在病理以及生理状态下均具有免疫调节功能。研究显示，γδT细胞能高表达细胞因子TGF-β1调节免疫，而不是表达TH1细胞的炎性因子IFN-γ[8-9]。

本研究表明，狼疮性肾炎模型小鼠肾组织中存在γδT的浸润，并发现肾组织中γδT存在TGF-β1的高表达，高表达的TGF-β1与尿蛋白水平呈负相关。因此，我们推测狼疮性肾炎小鼠肾组织炎症导致了某种特异抗原分子的释放，激活并诱导了γδT细胞在肾脏中参与固有免疫活动，γδT细胞在肾脏同样以限制性亚群表达。活化的γδT细胞同样具有调节性T细胞功能，对SLE肾组织表现为保护性作用。

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