王 松， 王 微， 罗 猛， 赵修华， 祖元刚， 赵艳丽

(东北林业大学教育部林业生物制剂工程研究中心森林植物生态学重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)

炎症是机体受到各种致炎因素的刺激和损伤后为灭活及移除这些致炎因素并为组织修复创造环境而产生的防御性反应，是一种十分常见而又重要的基本病理过程，是许多疾病的症状或并发症，可引起局部或全身性反应。其主要由细菌和病毒引起，也可因物理、化学、外伤等刺激而产生［1］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌细胞壁的组成成分，为重要的炎症反应触发剂，并诱导多种细胞因子参与炎症反应。在炎症反应中，巨噬细胞起着重要作用，是体内启动炎症介质产生的中心细胞，活化的巨噬细胞即是参与炎症反应的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白介素 IL-1β、-6、-10 等细胞因子的重要来源［2-4］，为调控炎症反应的主要细胞，由炎症反应所致免疫防御和免疫功能紊乱过程中，巨噬细胞是一个关键的参与者。所以，研究LPS刺激巨噬细胞产生促炎性和抗炎性细胞因子的效应，有助于人们对炎症反应机制的认识，并寻找到其有效防治手段。

在日本米诺发源制药株式会社研制的复方甘草酸苷(compound glycyrrhizin，GL)片剂(GLT)和注射剂(GLI)2种剂型中，GLT主要成分为甘草酸苷(即甘草酸单铵盐)、甘氨酸和蛋氨酸，而GLI则以甘草酸苷、盐酸半胱氨酸和甘氨酸为主成分，辅料有亚硫酸钠、适量氨水和氯化钠。这2种复方制剂均具有抗炎和类盐皮质激素的作用，同时还具有抑制病毒增殖、免疫调节、降低转氨酶、改善肝组织损伤、抗变态反应、抗氧化、保护细胞膜结构等多种生物学作用，临床上主要用于治疗慢性肝炎、湿疹、皮肤炎、过敏性紫癜、水痘、银屑病及斑秃等疾病，并有良好疗效［5-6］。研究表明，炎症反应其本质就是机体内促炎-抗炎自稳失衡所致。在参与炎症反应的众多因子中，最重要的是炎症因子TNF-α及IL-1β、-6和-10以及炎症介质一氧化氮(NO)，它们与内毒素休克的发病与致死具有密切关联［7-9］。本文旨在通过研究GLT和GLI对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌促炎和抗炎细胞因子TNF-α及IL-1β、-6和-10以及炎症介质NO的调节作用，探讨GL的抗炎作用机制，为其用于临床治疗提供实验依据。其间，选用地塞米松作为阳性对照药，它为一种糖皮质激素类抗炎药，可部分抑制NO生成，其作用确切，临床应用广泛。

1 材料

1.1 药物与试剂

高糖DMEM培养基，胎牛血清，青霉素，链霉素，均为Hyclone公司产品;胰蛋白酶(Gibco公司);EDTA，MTT(噻唑蓝)，LPS，均为 Sigma公司产品;二甲基亚砜(DMSO，Amerseco公司);NO检测试剂盒(碧云天生物技术研究所);小鼠的TNF-α及IL-6、-1β和-10的ELISA试剂盒(ELISA Kits，R＆D公司);GLT(每片含甘草酸苷35 mg，批号:09059)，GLI(每支20 mL，含甘草酸苷 53 mg，批号:E0211)，均为卫材(中国)药业有限公司产品;地塞米松(Sigma公司)。

1.2 细胞株

小鼠巨噬细胞RAW264.7，购自中国科学院上海细胞库。

1.3 仪器

DL-CJ-2N型超净工作台(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);DK-98-1型电子恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司);LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂);StatFax-2100型酶标仪(美国Awareness公司);CO2培养箱(SIM公司);TS-100型倒置显微镜(美国AWARENESS公司)。

2 方法

2.1 药物溶液配制

GLT药液配制:取GLT，用研钵研成粉末，置于139 mL含有2%血清的DMEM培养液中，超声溶解，使甘草酸苷浓度为 300 μmol·L-1，放置过夜，使用前以0.45 μm滤膜过滤除菌，并用含有2%血清的DMEM培养液倍半稀释，使甘草酸苷浓度分别达150 和 75 μmol·L-1，即得 300、150 和 75 μmol·L-1的3个浓度GLT药液。

GLI药液配制:取 GLI，用含有 2%血清的DMEM培养液以10.5倍稀释，使甘草酸苷浓度为300 μmol·L-1，放置过夜，使用前同上处理和稀释，即得300、150 和75 μmol·L-1的3 个浓度 GLI药液。

地塞米松药液配制:取地塞米松粉末100 μg，溶解于2 mL含有2%血清的DMEM培养液中，制得浓度为127 μmol·L-1的药液，使用前再用培养液稀释至 1.27 μmol·L-1即可。

LPS溶液配制:取LPS粉末1 mg，溶解在1 mL生理盐水中，制成质量浓度为1000 mg·L-1的LPS溶液，使用前用含有2%血清的DMEM培养液稀释至10 或 1 mg·L-1即可。

2.2 细胞培养

将RAW 264.7细胞置于高糖DMEM培养基中，并添加10%胎牛血清以及青霉素和链霉素各100 mg·L-1，随后在 37 ℃、潮湿、含5%CO2的培养箱中培养。

2.3 MTT实验

取对数生长期的RAW 264.7细胞，制得细胞浓度为每毫升4×105个的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，培养过夜;吸弃各孔培养液，分组处理，即GLT和GLI药液各浓度组分别加入300、150 和75 μmol·L-13 个浓度的相应药液，LPS模型组加1 mg·L-1LPS溶液，空白对照组加含2%胎牛血清的DMEM培养液，每组平行5孔，各孔加液体积为200 μL，继续培养;24 h后，各孔加入20 μL MTT 的生理盐水溶液(5 g·L-1)，再培养4 h;吸弃培养液，每孔加入150 μL DMSO溶解，水平振荡器摇动10 min，用酶标仪在检测波长492 nm和参比波长630 nm下测定吸光值，计算各组细胞活力，并将空白对照组细胞活力计作100%。实验重复3次。

2.4 Griess实验

取对数生长期的RAW 264.7细胞，制得细胞浓度为每毫升4×105个的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，培养过夜;弃去各孔培养液，分组处理，即GLT和GLI药液各浓度组分别加入300、150和75μmol·L-13个浓度的相应药液，LPS模型组和空白对照组加含2%胎牛血清的DMEM 培养液，阳性对照组加 1.27 μmol·L-1地塞米松药液，每组平行5孔，各孔加液体积为180 μL;处理1 h后，空白对照组加入含2%胎牛血清的DMEM培养液，其他各组均加10 mg·L-1LPS溶液(LPS最终质量浓度为1 mg·L-1)，每孔加液体积为20 μL;培养24 h 后，吸取各孔培养液50 μL，加入等体积的Griess试剂1和试剂2，室温反应10 min，用酶标仪在540 nm处测定吸光值，依据所测亚硝酸盐浓度，推算各组细胞培养液中NO含量，继而计算各药液组对LPS处理的细胞产生NO的抑制率。实验重复3次，并进行组间比较。抑制率=(LPS模型组吸光值-各药液组吸光值)/(LPS模型组吸光值-空白组吸光值)×100%。

2.5 双抗体夹心ABC-ELISA实验

该项实验旨在考察不同浓度GLT和GLI药液对LPS刺激的RAW264.7细胞分泌促炎和抗炎细胞因子TNF-α及IL-1β、-6和-10的影响，其前部分细胞分组、处理等设计同“2.4”节;各组细胞培养24 h后，按照各细胞因子相应的ELISA试剂盒说明书操作，吸取各孔培养液，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光值，依据标准曲线，计算各组培养液中TNF-α及IL-1β、-6和-10的含量。实验重复3次，并进行组间比较。

2.6 数据分析

3 结果

3.1 复方甘草酸苷片剂和注射剂对细胞活力的影响

MTT实验结果显示，GLT和GLI药液各浓度组细胞活力与空白对照组和LPS模型组无显著差异(P＞0.05)(见图1)。提示，GLT和GLI药液在0～300 μmol·L-1浓度范围内对 RAW264.7 细胞的活力无影响。

图1 MTT实验中各组细胞活力比较(n=15)Figure 1 Comparison of cell viability among all groups in MTT test

3.2 复方甘草酸苷片剂和注射剂对脂多糖诱导细胞产生NO的抑制作用

Griess实验结果显示，LPS模型组细胞培养液中NO含量较空白对照组显著提高，说明LPS可诱导RAW264.7细胞产生大量的NO，体外炎症模型建立成功;GLI药液在75、150和300μmol·L-1浓度下对LPS诱导细胞产生NO的抑制率分别为13.8%、40.4%和53.8%，而GLT药液在这3个浓度下的抑制率分别为9.8%、27.1%和37.8%，地塞米松在1.27 μmol·L-1浓度下的抑制率为27.1%(见图2)。表明，GLT和GLI能不同程度地显著抑制LPS诱导细胞产生NO，并呈浓度依赖性，且其作用与阳性对照药地塞米松类似，其中GLI的抑制作用稍强于GLT。

图2 Griess实验中各组细胞培养液的亚硝酸盐浓度比较(n=15)Figure 2 Comparison of nitrite concentration in cell culture among all groups in Griess test

3.3 复方甘草酸苷片剂和注射剂对脂多糖诱导细胞分泌TNF-α及IL-1β、-6和-10的影响

ELISA实验结果显示，与空白对照组比较，LPS模型组细胞培养液中的TNF-α及IL-1β、-6和-10含量显著提高;与LPS模型组比较，在75、150和300 μmol·L-1的GLI药液组细胞培养液中TNF-α含量分别降低29.8%、41.5%和52.1%，IL-1β含量分别降低39.5%、55.6%和69.6%，IL-6含量分别降低18.3%、29.5%和39.1%，IL-10含量则分别提高8.2%、23.8% 和 30.8%，而在 75、150 和 300 μmol·L-1的GLT药液组细胞培养液中，TNF-α含量分别降低16.6%、37.0%和48.4%，IL-1β含量分别降低28.1%、47.9%和57.9%，IL-6含量分别降低13.5%、19.9%和28.2%，IL-10含量则分别提高3.9%、14.8%和23.4%，此外，阳性对照组细胞培养液中TNF-α及IL-1β和-6含量分别降低47.5%、53.8%和44.7%，IL-10 含量则提高 23.0%(见图 3、4、5、6)。可见，GLT和GLI能不同程度地显著抑制LPS诱导细胞分泌TNF-α及IL-1β和-6以及进一步促进细胞分泌IL-10，并呈浓度依赖性，且其作用与阳性对照药地塞米松类似，其中GLI的作用强于GLT。

图3 ELISA实验中各组细胞培养液的TNF-α含量比较(n=15)Figure 3 Comparison of TNF-α content in cell culture among all groups in ELISA test

图4 ELISA实验中各组细胞培养液的IL-1β含量比较(n=15)Figure 4 Comparison of IL-1β content in cell culture among all groups in ELISA test

图5 ELISA实验中各组细胞培养液的IL-6含量比较(n=15)Figure 5 Comparison of IL-6 content in cell culture among all groups in ELISA test

图6 ELISA实验中各组细胞培养液的IL-10含量比较(n=15)Figure 6 Comparison of IL-10 content in cell culture among all groups in ELISA test

4 讨论

GL目前已在临床上广泛应用，疗效显著，而抗炎是其主要药理作用。NF-κB作为一种核转录因子，具有调节炎症、疼痛、病毒复制以及一些免疫疾病中关键因子基因表达的作用，如在炎症发生过程中，其能调节IL-1β、TNF-α、诱导型NO合酶(iNOS)等基因的表达，故阻断NF-κB通路是抗炎治疗的有效途径［10-11］，包括地塞米松等抗炎药都是通过抑制NF-κB 的活性来降低 IL-1β、TNF-α、NO 等的生成，从而达到治疗目的。本研究成功建立了LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7体外炎症模型，并考察了GL在不同浓度下对其中NO、TNF-α及IL-1β、-6和-10等炎症因子分泌的调节作用，在细胞水平上证实了GL具有与地塞米松等甾体类药物相似的良好抗炎活性。

在本研究中，考虑到GLI原液的浓度约为3154 μmol·L-1，而作用于细胞的药物浓度过高(即稀释倍数过低)可能会因毒性作用而影响细胞正常生长，导致实验结果不准确，所以，基于预实验和GLI市面上出售的药品规格，把GLT和GLI药液的实验浓度选定稀释在0～300 μmol·L-1范围内。结果表明，与LPS模型组相比，GL可浓度依赖性地显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO、TNF-α、IL-1β和-6等促炎因子，并能促进抗炎因子IL-10的产生，显示了其体外抗炎效应。其中，在高浓度下，GLI对NO、TNF-α和IL-1β的细胞分泌抑制率都超过50%，而GLT只有对IL-1β的细胞分泌抑制率超过50%，且整体实验结果也显示，GLI的各项体外抗炎活性数据均优于GLT。究其个中缘由，笔者以为，可能与注射液对生产工艺以及药物纯度等各方面的要求严于或优于片剂有关。

依据本研究结果，可以初步推测GL的抗炎作用机制是阻断NF-κB活性，因此笔者所在研究团队下一步将深入探究GL对NF-κB等通路的作用，进一步阐释GL的抗炎机制。

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