孙丽丽 （山东省诸城市畜牧兽医管理局 262200）



尼帕病毒病诊断技术

孙丽丽 （山东省诸城市畜牧兽医管理局 262200）

尼帕病毒病是由尼帕病毒(Nipah virus)感染引起的人畜共患病。其特征为急性发热性脑炎和高死亡率。病原体是副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)的亨尼帕属(Henipavirus)成员，毒力强。本文就尼帕病毒病诊断技术进行简要概述。

1 病原学诊断技术

1.1 病毒分离 在无菌情况下处理受检样品。用密闭的匀浆器处理含10%(w/v)组织样品的悬浮液，如在密闭的金属筒中用高压灭菌的金属球进行研磨，或者在罩袋式匀浆器中进行研磨。样品磨碎后，300g离心，将上清加入到培养的Vero细胞或兔肾细胞(RK-13)中。NiV感染细胞后，引起的CPE的特征是出现细胞融合现象：经过24~48h，有些融合的细胞可含有60个以上的细胞核，并且融合细胞的细胞核分布在融合细胞的周围。如果没有出现CPE，应该再盲传2次，每次培养5d。

1.2 分子生物学诊断 对于Nipah病毒与Hendra病毒的诊断，PCR检测是很常规的方法，AAHL所建立的方法，是基于Nipah病毒与Hendra病毒的M蛋白基因的保守序列所设计的引物，进行巢式PCR扩增。这种RT-PCR方法可以用于固定的或新鲜的组织样品进行诊断，或对脑脊髓液进行诊断，也可以对细胞培养分离物进行快速鉴定。在美国CDC使用的是另一种方法，这种PCR是基于N基因之上的，在刚开始使用的PCR方法是基于P基因。Real time–PCR具有快速、准确的特点，也被应用于对这两种病毒的检测，Smith等首先建立了针对Hendra病毒M基因的Real time–PCR检测方法，可以在4h内得到检测结果。Guillaume等建立了针对Nipah病毒N基因的Real time–PCR检测方法，检测灵敏度能达1PFU的病毒量，该方法适合对自然感染样品或流行病学样本进行检测。

1.3 组织病理学诊断 免疫组织化学包括免疫荧光，免疫酶染色试验，金标记抗体试验等，被证实是检测Nipah病毒最有效的方法之一。通过福尔马林固定组织，这种方法不仅安全，而且还可以对以前采集的组织病料进行回顾性调查。免疫组化试验检测部位包括脑组织、肺脏、肠系膜淋巴结、肾脏等，怀孕动物还应该送检子宫、胎盘以及胎儿组织等。

2 血清学诊断技术

2.1 血清中和试验 血清中和试验在某种程度被当作结果判定的标准方法(Golden standard)，对于通过其他试验所得到的阳性或可疑结果，均需要通过血清中和试验进行验证。其操作是在P4条件下，血清和病毒在96孔中预先温育后，再加入到有Vero细胞的孔中，血清筛选使用的稀释度为1:2(对于血样来源贫乏者，例如所采集的动物是濒死的飞狐和小蝙蝠，初始的血清稀释度可以设为1:5)，这种稀释度偶尔会产生细胞毒性。培养3d后观察结果，那些彻底阻止出现CPE的血清记为阳性。

2.2 ELISA检测 ELISA方法以其敏感、快速和高通量的特点，非常适合作为流行病学调查和血清学筛查工具。由于Nipah病毒与Hendra病毒有交叉反应，因此早期在马来西亚是使用灭活的Hendra病毒来作为检测抗原的，并建立了血清IgM、IgG的检测方法。Ramasundram等研究表明，病人感染4d后，脑脊液中的IgM抗体阳转率为65%，而12d后阳转率达到100%，并可维持3个月的时间，感染后25dIgG抗体阳转率为100%。

由于该病毒高度危险，一般的实验室不能进行病毒的培养，所以使用基因工程表达的重组蛋白作为检测抗原显示了良好的应用前景，在未出现该病毒的国家，特别适合应用这种方法生产抗原来进行流行病学调查。利用原核系统对Nipah病毒N蛋白进行重组表达，表达产物能很好的和感染猪血清中的抗体反应；用杆状病毒表达系统对Nipah病毒N蛋白进行表达，检测结果提示重组N蛋白可以代替全病毒作为ELISA检测抗原。分别在杆状病毒表达系统和大肠杆菌中对Nipah病毒G的胞外区基因进行表达，结果发现表达的蛋白作为抗原适用于常规的Nipah病毒抗体检测，也可以应用于血清学的流行病学调查。尽管ELISA方法特异性较高，但其判定条件需要仔细评估，对阳性样本现在通常使用血清中和实验进行验证，只有那些在两个体系中均反应的样本才能被认为是阳性的。采样时需要在第一次采样以后3周时，再抽样检测1次，以便留下时间使阳转的血清得以检出，如此反复的检测，一直到确信感染在整个被检测的畜群中被消除了为止。

2.3 单抗检测 单抗具有特异性强，敏感性高的特点广泛应用于对病原及其特异性抗体的免疫学鉴定，目前已经有关于针对两种病毒单抗制备及其在诊断实验中应用的报道。用福尔马林灭活的Nipah病毒作为抗原制备8株单克隆抗体，将这些单抗应用于免疫组化实验，其中有2株单抗只和Nipah病毒感染的猪肺脏组织反应，而不和Hendra病毒感染的马肺脏组织反应，显示这两株单抗在鉴别诊断方面具有独特的作用。利用其中1株针对Nipah病毒的特异性单抗，建立了一种阻断ELISA方法，可检测感染猪血清中的Nipah病毒抗体，结果和血清中和实验有很好的符合率，这种方法也可以应用于对各种动物血清抗体的检测。利用灭活的Nipah病毒免疫小鼠，制备5株针对Nipah病毒的IgG单抗，通过Western blot鉴定了这些单抗针对的特异性结构蛋白，其中4株是针对N蛋白的，1株是针对M蛋白的。在体外实验中，所有的单抗均没有中和作用，所有单抗均可用于ELISA实验和免疫荧光实验，但是F45G2(抗N)最适合做长时间福尔马林固定组织的免疫荧光；三株针对N的的单抗能和Hendra病毒N产生交叉反应；一株针对N的和一株针对M的单抗不和Hendra病毒产生交叉反应，显示在未来的实验中具有鉴别诊断意义。

（2012–05–14）

S855.3

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1007-1733(2012)09-0042-02