陈伟新 杨立群

（1.复旦大学附属中山医院青浦分院普外科，上海 201700；2.第二军医大学附属东方肝胆医院ICU，上海 200433）

文献［1］报道乌司他丁（ulinastatin，UTI）预处理对大鼠肝脏缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）损伤具有保护作用，它可以选择性降低再灌注时活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的产生，并且减轻肝细胞的坏死和凋亡，但其具体机制目前尚不清楚。高迁移率蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）是一种重要的内源性损伤相关分子，它广泛分布于哺乳动物淋巴组织及脑、肝、肺、心、脾、肾等器官中，它在肝、脑组织中主要存在于胞浆，但在大多数其他组织中存在于胞核。生理状态下HMGB1的表达量维持在极低的基础水平［2］。HMGB1介导了内毒素诱导的脓毒症，其是内毒素致死效应的晚期重要炎症介质。HMGB1在体内不同器官分布广泛，但目前尚无报道HMGB1是否参与了UTI抑制肝脏IR后炎性反应的过程，本研究旨在探讨这一问题。

1 资料与方法

1.1 实验动物 SD雄性大鼠40只，体质量250～300g，由第二军医大学实验动物中心提供。大鼠在空调室内饲养，室温22～25℃，自由进水和食物，术前12h禁食不禁水。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及模型的制作 首先将SD大鼠随机分为4组。建立左、中肝门静脉阻断的IR模型，先阻断大鼠门静脉左、中分支45min，然后开放动脉夹再灌注2h。0.9%氯化钠对照组（对照组，n＝10）：再灌注前5min尾静脉注射0.9%氯化钠溶液6mL／kg。UTI预处理组（UTI组，n＝10）：再灌注前5min尾静脉注射 UTI（20U／mL）1.5mL／kg。UTI＋诱导剂组（UTI＋rHMGB1组，n＝10）：阻断前1h予重组HMGB1蛋白10μg腹腔注射，余同 UTI组。UTI＋拮抗剂组（UTI＋Anti－HMGB1组，n＝10）：阻断前1h予 Anti－HMGB1抗体100μg腹腔注射，余同UTI组。

1.2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆中细胞因子的水平 再灌注后取新鲜血液4～5mL，37℃静置30min、4℃静置2h后3 000r／min离心15min，小心吸取上层血清200μL装于EP管中，采用TNF－α和IL－1特异性ELISA试剂盒，根据说明书步骤操作。

1.2.3 肝组织光镜标本HE染色病理观察 光镜下评定肝组织损伤分级，其分级标准：0级，肝小叶、肝细胞、肝细胞索、中央静脉、肝窦均正常；Ⅰ级，肝中央静脉、肝窦内瘀血及少量肝细胞变性坏死，肝组织内可见炎细胞聚集，肝小叶结构完整；Ⅱ级，肝中央静脉、肝窦内瘀血及较多肝细胞变性坏死，肝组织内炎细胞聚集较多，肝小叶结构尚完整；Ⅲ级，肝中央静脉、肝窦内瘀血及广泛肝细胞变性坏死，大量炎细胞聚集，部分肝组织结构破坏不完整。

1.2.4 肝脏组织HMGB1蛋白表达 采用免疫组织化学染色（S－P法）检测。肝组织HMGB1表达结果判断方法：在显微镜下观察染色结果，阳性为细胞膜、细胞质或细胞核上棕黄色颗粒样沉淀。－：细胞膜不着色，与背景一致；＋：膜呈棕黄色的细胞数＜25%或大多数细胞的膜呈淡黄色；＋＋：膜呈棕黄色的细胞数占25%～80%。

1.3 统计学处理 采用SPSS软件进行相关数据统计分析，计算平均值、标准差，并进行正态性检验和方差齐性检验。对符合正态分布和方差齐性的资料进行单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用q检验。对不符合正态分布的资料和等级资料计算中位数（median，M）和四分位数（quartile，Q），进行非参数Kruskal－Wallis检验，组间两两比较采用Nemenyi法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的比较 见表1。

2.2 各组血清细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF－α）和白细胞介素（IL－1）含量的比较 见表2。2.3 肝组织病理学及HMGB1蛋白表达水平的改变 UTI组和UTI＋Anti－HMGB1组肝细胞坏死和中性粒细胞浸润显著轻于对照组，见图1；且UTI组和UTI＋Anti－HMGB1组肝细胞 HMGB1的表达程度显著低于其他两组（P＜0.05），见图2。

表1 ALT和AST在各组中的比较

表2 TNF－α和IL－1在各组中的比较

3 讨 论

UTI是从人尿中提取精制的一种糖蛋白水解酶抑制剂，又称尿胰蛋白酶抑制剂，其相对分子质量为67 000，它对胰蛋白酶、糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶及粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、琉基酶、纤溶酶等多种酶具有抑制作用。UTI分解形成的相对分子质量较低的成分也具有很强的抑制蛋白水解酶的作用［3］。本研究发现UTI预处理后，UTI组IR后血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）与对照组相比均显著降低，表明UTI预处理对肝细胞具有保护作用。UTI组IR后血清TNF－α和IL1水平与对照组相比均显著降低，表明UTI预处理是通过抑制炎性细胞因子的释放发挥其对肝细胞的保护作用，病理观察结果也证实了这一点。

高迁移率族蛋白（high mobility group，HMG）由Johns于1973年首次在牛胸腺中提取和鉴定，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中具有高迁移能力而得名。根据分子质量大小、序列相似性和DNA结构特性，HMG 可进一步分为 HMGA、HMGB、HMGN 3个家族。HMGB家族有3个成员，即HMGB1、HMGB2和HMGB3，三者在氨基酸序列上有80%的一致性。HMGB1是含量最丰富的HMG蛋白［4］。在正常情况下，HMGB1一部分存在于肝细胞胞浆中，一部分存在于肝细胞胞核维持DNA结构。当细胞坏死或受损时，核内的HMGB1可释放到胞外，促使单核巨噬细胞分泌促炎因子；而促炎因子又反过来促进巨噬细胞主动分泌HMGB1，由此形成正反馈。IR诱导的肝损伤中，肝细胞大量坏死、细胞膜结构断裂、胞核结构破裂，HMGB1被动释放至细胞外，作为重要炎症启动因子介导IR后炎性反应。另外，在缺血的伤害性刺激因素作用下，肝脏内库弗氏细胞主动分泌HMGB1至胞外。Tsung等［5］发现大鼠肝脏IR损伤后HMGB1的表达增强，其表达从再灌注后1h即开始上调并持续至再灌注后24h，且呈时间依赖性。通过本实验我们证实了HMGB1可以拮抗UTI对肝脏IR损伤后炎性反应的抑制作用。

综上所述，我们认为内源性损伤蛋白HMGB1介导的炎性通路与UTI对肝IR损伤的保护作用机制有关。

［1］ Jovin TM.HMG－1protein stimulates DNA end joining by promoting association of DNA molecular via their ends［J］.Eur J Biochem，2000，267（13）：4088－4097.

［2］ Li J，Kokkola R，Tabibzadeh S，et al.Structural basis for the proinflammatory cytokine activity of high mobility group box 1［J］.Mol Med，2003，9（1－2）：37－45.

［3］ Noie T，Sugawara Y，Harihara Y，et al.Kinetics of urinary trypsin inhibitor in patients undergoing partial hepatectomy［J］.Scand J Gastroenterol，2001，36（4）：410－416.

［4］ Bustin M，Lehn DA，Landsman D.Structual features of the HMG chromosomal proteins and their genes［J］.Biochim Biophys Acta，1990，1049（3）：231－243.

［5］ Tsung A，Sahai R，Tanaka H，et al.The nuclear factor HMGB1mediates hepatic injury after murine liver ischemiareperfusion［J］.J Exp Med，2005，201（7）：1135－1143.