高地 朱鹭冰 李明

（复旦大学附属中山医院皮肤科，上海 200032）

系统性硬皮病（systemic scleroderma，SSc）是一种顽固的自身免疫性疾病，其免疫紊乱表现在多个方面。免疫活性细胞（主要是淋巴细胞）及其相关细胞因子和趋化因子在SSc发病机制中的作用逐渐引起关注［1］。我们的前期研究［2］显示皮肤成纤维细胞外微环境中细胞因子异常可能参与SSc患者皮肤成纤维细胞高胶原合成克隆的形成。外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）以淋巴细胞为主，能产生多种细胞因子。本研究旨在探讨SSc患者的PBMC对具有不同胶原合成能力的皮肤克隆成纤维细胞的胶原代谢的影响。

1 资料与方法

1.1 实验材料 DMEM高糖培养基、胎牛血清由PAA公司生产；小鼠抗人波形蛋白、细胞角蛋白单抗由Abcam公司生产；兔抗人Ⅷ因子多抗由Antibody Diagnostica公司生产；亲和素－生物素－酶复合物显色试剂盒和生物素化马抗小鼠、羊抗兔二抗由Vector公司生产；RNA提取试剂盒由Invitrogen公司生产和cDNA合成试剂盒、荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒、引物和TaqMan探针由上海闪晶公司生产；淋巴细胞分离液、植物血凝素（phytohemaggtutinin，PHA）由Sigma公司生产。

1.2 研究方法

1.2.1 筛选SSc和健康皮肤具有不同胶原合成能力的异质性成纤维细胞克隆 选取5例病程＜3年且符合美国风湿病学会1980年分类标准［3］的进展期SSc患者（研究组）分别在局部麻醉下切取其前臂逐渐扩大的硬化皮损边缘的皮肤组织；同时选取4例性别、年龄匹配的整形外科手术者（对照组），在局部麻醉下切取其相应部位的健康皮肤组织。所有研究对象均知情同意。

采用组织块培养法原代培养成纤维细胞并传代增殖，对第2代细胞进行免疫组织化学鉴定并采用改良有限稀释法分离克隆。采用实时荧光定量逆转录－聚合酶链反应（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）法检测克隆成纤维细胞内Ⅰ型前胶原的mRNA水平［4］。

1.2.2 PBMC的分离 无菌采集对照组和研究组病情活动期患者各3例的静脉血5mL，加入盛有肝素的无菌小瓶，加盖后轻轻摇匀。取抗凝血，计数白细胞总数后，采用密度梯度离心法分离PBMC，以Hanks液重悬细胞，洗涤2次后计数细胞。根据计数结果，将PBMC稀释至106／mL（细胞悬液片含5μg／mL PHA），接种于25cm2培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱中培养48h。离心，收集上清液。

1.2.3 PBMC对SSc皮肤克隆成纤维细胞中Ⅰ型前胶原和基质金属蛋白酶1（matrix metalloproteinase－1，MMP－1）mRNA水平的影响 根据预实验，确定PBMC培养上清液的浓度为10%。在筛选出的SSc皮肤克隆成纤维细胞中，选取Ⅰ型前胶原mRNA高、低表达的克隆各3个，每个克隆经0.25%胰蛋白酶消化后，分别接种于4个3.5cm2培养皿，培养至80%融合时，弃生长培养液，换为含0.1%胎牛血清的DMEM高糖培养液培养24h，弃培养液，每个克隆提取其中1个培养皿细胞的总RNA，另外3个培养皿分为3组，分别为未干预组、研究组PBMC培养上清液干预组和对照组PBMC培养上清液干预组。按确定的PBMC培养上清液的终浓度（10%）配制含0.1%胎牛血清的DMEM高糖培养液，分别加入Ⅰ型前胶原mRNA高表达和低表达的SSc皮肤克隆成纤维细胞的细胞培养基中，培养48h后提取总RNA，与干预前提取的总RNA一起以实时荧光定量RT－PCR法检测Ⅰ型前胶原和MMP－1mRNA水平。采用各样品干预后与干预前目的基因mRNA的△CT的差△△CT表示干预因素的作用大小：△△CT绝对值大，表示干预因素作用大；反之，表示干预因素作用小；△△CT为正值，表示干预因素使目的基因mRNA的水平上升；△△CT为负值，表示干预因素使目的基因mRNA的水平下降。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.5软件进行统计学分析。计数资料以均数±标准差（¯x±s）表示。采用两因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 筛选SSc和正常皮肤具有不同胶原合成能力的异质性成纤维细胞克隆 研究组和对照组分别获得36个和32个皮肤成纤维细胞的克隆，其免疫组织化学结果显示：胞浆波形蛋白阳性、角蛋白阴性、Ⅷ因子阴性，符合成纤维细胞的特征。由于克隆细胞体外生存期有限，不可能对所有克隆进行测定，因此在获得的克隆中，检测研究组5例共25个克隆和对照组4例共21个克隆。通过样品聚类分析将Ⅰ型前胶原mRNA水平分为高表达（△CT＞1）、中表达（－1≤△CT≤1）和低表达（△CT＜－1），研究组高、低表达克隆数分别为12个和7个，对照组高、低表达克隆数分别为3个和5个。

2.2 PBMC对SSc皮肤克隆成纤维细胞Ⅰ型前胶原和MMP－1的mRNA水平的影响

2.2.1 PBMC对SSc皮肤克隆成纤维细胞中的Ⅰ型前胶原mRNA水平的影响 见表1。

2.2.2 PBMC对SSc皮肤克隆成纤维细胞中的MMP－1的mRNA水平的影响 见表2。

表1 PBMC对SSc患者Ⅰ型前胶原mRNA高和低表达皮肤克隆成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA水平的影响（¯x±s，△△CT）

表2 PBMC对SSc患者Ⅰ型前胶原mRNA高和低表达皮肤克隆成纤维细胞MMP－1mRNA水平的影响（¯x±s，△△CT）

3 讨 论

在SSc发病的早期，患者皮肤真皮下层存在以CD4＋T辅助细胞为主的淋巴细胞浸润，提示免疫活性细胞可能通过直接或间接产生细胞因子／趋化因子来诱导产生或调节“硬皮病成纤维细胞表型”［5－6］。研究［7］显示，SSc患者 PBMC 和皮肤 成纤维细胞共培养后，T淋巴细胞的寡克隆扩增与发生在皮肤的T淋巴细胞寡克隆扩增类似。

既往关于SSc患者PBMC培养上清与皮肤成纤维细胞共培养的研究均未考虑PBMC干预前成纤维细胞胶原合成能力对干预结果的影响，本研究以SSc皮肤克隆成纤维细胞作为研究对象，探讨PBMC对SSc具有不同胶原合成能力的皮肤克隆成纤维细胞的胶原代谢的影响。

本研究结果表明，SSc具有不同胶原合成能力的克隆成纤维细胞中Ⅰ型前胶原、MMP－1mRNA水平对PBMC的反应存在异质性。SSc患者PBMC培养上清与皮肤克隆成纤维细胞共培养48h，仅使具有低胶原合成能力的SSc克隆成纤维细胞的Ⅰ型前胶原和MMP－1mRNA水平上升，未发现其对高表达者有影响。

［1］ Gu YS，Kong J，Cheema GS，et al.The immunobiology of systemic sclerosis［J］.Semin Arthritis Rheum，2008，38（2）：132－160.

［2］ 高地，朱鹭冰，李明.细胞因子TGFβ1，CTGF和IFN－γ对系统性硬皮病克隆成纤维细胞胶原代谢的影响［J］.中国皮肤性病学杂志，2012，26（1）：9－11.

［3］ Subcommittee for scleroderma criteria of the American rheumatism association diagnostic and therapeutic criteria committee.Preliminary criteria for the classification of systemic sclerosis（scleroderma）［J］.Arthritis Rheum，1980，23（5）：581－590.

［4］ 高地，朱鹭冰，李明.系统性硬皮病患者皮肤克隆成纤维细胞胶原代谢的异质性［J］.中国皮肤性病学杂志，2010，24（12）：1092－1095.

［5］ Sakkas LI，Platsoucas CD.Is systemic sclerosis an antigendriven T cell disease？［J］.Arthritis Rheum，2004，50（6）：1721－1733.

［6］ Abraham DJ，Eckes B，Rajkumar V，et al.New developments in fibroblast and myofibroblast biology：implications for fibrosis and scleroderma［J］.Curr Rheumatol Rep，2007，9（2）：136－143.

［7］ De Palma R，Del Galdo F，Lupoli S，et al.Peripheral T lymphocytes from patients with early systemic sclerosis co－cultured with autologous fibroblasts undergo an oligoclonal expansion similar to that occurring in the skin［J］.Clin Exp Immunol，2006，144（1）：169－176.