杨冬，田靖斐，陈晟，吴敬

1 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122

2 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122

环糊精是由6个以上葡萄糖连结而成的环状低聚化合物，根据葡萄糖单元数目的不同，环糊精可以分为 α-、β-、γ-、d-环糊精等，其中最常见的是聚合度为6、7、8的α-、β-、γ-环糊精。由于环糊精分子具有独特的疏水空腔结构，能包合疏水性客体分子，从而改变客体分子的溶解度、稳定性等物理化学性质，因此在食品、医药、农业等领域具有广泛的应用[1]。

环糊精葡萄糖基转移酶 (CGT酶，EC 2. 4. 1. 19) 通过分子内的环化反应能利用淀粉生产环糊精，这是其工业应用的基础[2]。用CGT酶生产环糊精一个主要的不利条件是所有已知的野生型CGT酶生产的是α-、β-、γ-环糊精的混合物，这给产物的分离纯化带来很大不便。因为要从混合物中分离得到一种纯的环糊精需要通过有机溶剂络合沉淀等一系列的附加步骤，这不仅会大幅度增加生产成本，而且由于有机溶剂的毒性会限制环糊精在食品、医药、化妆品等工业中的使用[3]，因此研究CGT酶的产物特异性的作用机理使其更好地适应环糊精工业化生产的要求具有重要的意义[2,4]。

到目前为止，研究者对不同来源的 CGT酶进行了大量的定点突变，以期获得具有理想产物特异性的突变体。绝大多数的突变是针对于CGT酶活性中心底物结合凹槽附近的氨基酸残基[5-6]。X-射线衍射研究表明[7-10]，CGT酶活性中心凹槽至少包括 9个糖结合位点，标记为+2~−7，每个亚位点能结合一个葡萄糖残基。CGT酶的产物特异性取决于底物结合凹槽处亚位点数目和位置，在亚位点−1和+1之间的键断裂之前底物的非还原末端到达亚位点−6、−7或−8分别对应地生成产物α-、β-、γ-环糊精。研究表明，对底物结合凹槽周围亚位点处的一个或多个重要的氨基酸残基进行取代、插入或者删除等突变会改变CGT酶产物中α∶β∶γ比例[11-14]，暗示了CGT酶的一级结构是决定其产物特异性的主要内在因素。许多研究者对CGT酶产物特异性与其一级结构的相关性进行了大量研究。一些研究证实，亚位点−3和−7附近的氨基酸残基是影响CGT酶产物特异性的关键位点[11,15-18]。

目前，国内外已对α和β-CGT酶进行了大量深入的研究，但对γ-CGT酶的研究则比较少，目前只发现来源于Bacillus firmus 290-3，Bacillus sp. G-825-6，alkalophilic Bacillus clarkii 7364的CGT酶为γ-CGT酶，其中来源于B. clarkii 7 364的 γ-CGT酶由日本科学家首次发现[19]，其通过环化反应转化淀粉的产物主要为γ-环糊精，它的这种性质使其成为理想的研究CGT酶产物特异性的对象。

本实验以 B. clarkii 7364 CGT酶为研究对象，通过对不同来源的CGT酶蛋白质序列进行多重序列比对发现，在亚位点−7处，从 141位氨基酸开始，γ-CGT酶缺失了存在于α及β-CGT酶中的6个氨基酸，相应的位置只有142位的天冬氨酸，基于以上分析，本研究试图通过重叠PCR的方法将γ-CGT酶142位天冬氨酸用β-CGT酶中保守的6个氨基酸替换，以探讨该6个氨基酸是否是导致CGT酶产物特异性产生差异的原因，从而为通过分子改造得到理想产物特异性的CGT酶提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

重组质粒 pET-20b+/cgt由本实验室构建并保藏。克隆宿主菌E. coli JM109和表达宿主菌E. coli BL21 (DE3) 由本实验室保藏。克隆质粒pMD18T-simple和表达质粒pET-20b (+) 购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.2 酶和试剂

质粒小量提取试剂盒购自上海生工生物工程公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq酶、primerStarDNA聚合酶购自TaKaRa公司，氨苄青霉素、CIAP 购自华美生物工程公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

培养基LB、TB、SOB均按Invitrogen公司操作手册方法配制。

1.2 方法

1.2.1 突变体的克隆

根据B. clarkii 7364 γ-CGT酶基因序列为模板，设计如下4条引物 (表1)，F和R为基因上下游引物，在引物的末端分别引入酶切位点NcoⅠ (CCATGG) 和 EcoRⅠ (GAATCC)，Fm和Rm为突变位点的上下游引物。下划线部分为突变位点核酸序列。

表1 突变引物Table 1 Mutant primers used in PCR reactions

分别以F/Fm以及Rm/R为引物，扩增出含有突变位点的片段A和B。

PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。

PCR产物纯化后，作为第2次重叠PCR的模板。向PCR反应体系中加入等摩尔的片段A和B，不加入引物F和R，交错延伸5个循环，PCR扩增条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55℃1 min，72 ℃ 2.5 min；72 ℃延伸10 min。然后加入引物F和R，扩增30个循环，PCR扩增条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃2.5 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。

PCR产物纯化后，16 ℃连接 pMD18T-simple，连接产物转化E. coli JM109，挑取阳性克隆，双酶切鉴定后，送上海生物工程有限公司测序。

测序正确的突变体基因双酶切后，胶回收得到目的基因片段，16 ℃连接表达载体 pET-20b (+)，转化E. coli JM109，提取质粒，双酶切鉴定阳性克隆。

鉴定正确的表达质粒热激转化E. coli BL21 (DE3)，挑取单菌落接种LB培养基，保存菌种。

1.2.2 突变体的胞外表达

种子培养：将保藏的菌种接入装有50 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，接种量为0.1%，回旋式摇床转速200 r/min，培养温度为37 ℃，培养8 h。

发酵培养：将培养好的种子培养液按 5% (V/V) 的接种量，接种至装有100 mL TB培养基的500 mL三角瓶中进行发酵培养，开始培养温度为37 ℃，摇床转速200 r/min，当菌体培养至OD600为0.6时，添加IPTG至0.01 mmol/L，迅速转至25 ℃摇床，继续诱导72 h。

各培养基中使用前添加100 mg/L氨苄青霉素。

1.2.3 突变体的纯化

含有突变质粒的基因工程菌培养 72 h后的发酵液在12 000 r/min下离心20 min除去菌体，获得上清液。上清液经过70% (W/V) 硫酸铵沉淀过夜后，沉淀物用适量缓冲液 A (50 mmol/L NaCl，pH 10.0) 溶解，并在缓冲液A中透析过夜，得到Ni柱亲和层析的上样样品。Ni亲和柱用缓冲液A平衡后上样，然后分别用缓冲液A、含0~480 mmol/L咪唑的缓冲液A、含480 mmol/L咪唑的缓冲液A洗脱，分步收集。含CGT酶的组分在50 mmol/L NaCl (pH 10.0) 中透析过夜，纯化的重组CGT酶在−80 ℃保存。

1.2.4 酶活测定

甲基橙法测定α-环化活力的方法如下[20]：取适当稀释的酶液0.1 mL，加入装有0.9 mL预先用50 mmol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液 (pH 10.0)配制的3% (W/V) 可溶性淀粉溶液的试管中，在40 ℃下反应10 min后，加入1.0 mL 1.0 mol/L 的盐酸停止反应，再加入1.0 mL用50 mmol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液配制的 0.1 mmol/L 甲基橙，在20 ℃下保温20 min，在505 nm下测定吸光度。对应 α-环糊精标准曲线计算出环糊精浓度，一个酶活单位 (U) 定义为在上述条件下每分钟生成1 μmol的α-环糊精所需的酶量。

酚酞法测定b-环化活力的方法如下[21]：取适当稀释的酶液0.1 mL，加入装有0.9 mL预先用50 mmol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液 (pH 10.0) 配制的 3% (W/V) 可溶性淀粉溶液的试管中，在40 ℃下反应10 min后，加入3.5 mL 30 mmol/L NaOH和0.5 mL由5 mmol/L Na2CO3溶液配制的0.02% (W/V) 酚酞停止反应，在室温下保温20 min，在550 nm下测定吸光度。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1 μmol b-环糊精所需的酶量。

溴甲酚氯法测定g-环化活力的方法如下[22]：取适当稀释的酶液0.1 mL，加入装有0.9 mL预先用50 mmol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液 (pH 10.0) 配制的 3% (W/V) 可溶性淀粉溶液的试管中，在40 ℃下反应10 min后，加入50 mL 1.0 mol/L的盐酸停止反应，再加入2 mL 0.2 mol/L柠檬酸缓冲液 (pH 4.2) 和100 μL 5 mmol/L 溴甲酚氯溶液，在室温下保温20 min，在630 nm下测定吸光度。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1 μmol g-环糊精所需的酶量。

1.2.5 蛋白质浓度测定

蛋白质浓度测定使用Bradford法，使用牛血清蛋白作为标准品[23]。

1.2.6 突变体的结构模拟

野生和突变 CGT酶的理论结构通过SWISS-MODEL蛋白模拟在线服务器 (http:// www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html)进行同源模拟获得[24-26]。

1.2.7 产物特异性分析

采用高效液相色谱法 (HPLC) 测定。配制5% (W/V) 可溶性淀粉溶液作为底物，5 g淀粉溶解在90 mL 50 mmol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液(野生型pH为10.0，突变体pH为9.0) 中，定容至100 mL，在沸水中煮沸30 min。加入一定量的野生型和突变体CGT酶使反应体系中酶活为0.2 U/mL，置于50 ℃、200 r/min摇床中反应12 h，隔时间取样600 μL，12 000 r/min离心10 min，取上清500 μL，加5 μL糖化酶 (70 U/mL)，在30 ℃糖化1 h，10 min煮沸灭活，12 000 r/min离心30 min，取上清0.45 μm超滤膜过滤后取20 μL上机分析。采用HPLC进行产物分析的色谱条件是：Waters 600HPLC色谱仪，Waters自动进样器，色谱柱 Lichrosorb NH2(4.6 mm× 150 mm)，Waters2410示差检测器；流动相 (V/V)为70%乙腈水溶液，流速0.8 mL/min；柱温30 ℃。

2 结果与分析

2.1 γ-CGT酶产物特异性位点分析

来源于B. circulans 251的β-CGT酶与麦芽九糖抑制剂的复合结构表明，在 β-CGT酶中，亚位点−7处氨基酸与作为中间产物还原末端的第9个葡萄糖通过氢键相互作用 (图1)，对其进行空间定位，其后这个葡萄糖会在其他氨基酸的作用下发生空间偏移，与亚位点−1处的葡萄糖相互作用形成α-1,4糖苷键，环化产物形成，因此亚位点−7处的相关氨基酸对CGT酶的产物特异性起着非常关键的作用[7-9]。

利用EBI (www.ebi.ac.uk) 的在线clustalw2工具，对不同来源 CGT酶氨基酸序列进行多重序列比对。其中来源于 Thermoanaerobacter sp. ATCC53、 T. thermosulfurigenes EM1、 B. stearothermophylus strain NO2的CGT酶主要产物为α-环糊精，而来源于B. firmus 290-3、Bacillus sp. G-825-6、B. clarkii 7364的CGT酶主要产生γ-环糊精，其余均以产生β-环糊精为主 (图2)[2,5]。

多重序列比对结果表明，γ-CGT酶在亚位点−7处只有 142位天冬氨酸的存在，缺失另外 6个存在于α及β-CGT酶中的氨基酸。

通过SWISS-MODEL蛋白模拟在线服务器，以来自Geobacillus stearothermophilus CGT酶的结构为模板 (PDB编号：1CYG)，成功模拟得到野生型γ-CGT酶的结构，与已经解析出的CGT酶晶体结构相比，γ-CGT酶的整体结构并没有大的变化，整个酶分子同β-CGT酶一样由5个结构域组成，主链的空间走向也基本一致，但在亚位点−7处，局部结构发生了比较明显的变化 (图3)，由于亚位点−7处6个氨基酸的缺失，使得此位置的氨基酸链变短，而该结构构象的变化有可能是导致 γ-CGT酶具有较高的产物特异性的原因。因此，本研究拟在γ-CGT酶亚位点−7处通过突变将142位天冬氨酸用来源于β-CGT酶的保守氨基酸SSDDPFF替换，来探讨这种插入突变对其产物特异性的影响。

图1 来源于碱性芽胞杆菌251的CGT酶与麦芽九糖抑制剂在活性位点上相互作用示意图[8]Fig. 1 Schematic representation of the interactions of B. circulans strain 251 CGTase with a maltononaose substrate at the active site[8].

图2 不同来源CGT酶的多重序列比对结果Fig. 2 Multiple alignment of amino acid sequences of CGTase.

图3 β-CGT酶晶体结构与模拟γ-CGT酶结构对比Fig. 3 Alignment of γ-CGTase model structure with β-CGTase crystal structure.

2.2 突变体的克隆表达

通过 overlapPCR扩增出突变基因。突变基因连接pMD-18T后进行测序，突变位点正确突变。将突变基因克隆至 pET-20b (+)，转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，挑取阳性克隆进行培养，SDS-PAGE鉴定发现，突变体成功表达 (图4)。粗酶液经 Ni-柱纯化，得到电泳纯蛋白 (图5)。检测纯化后突变酶和野生酶的环糊精形成活力，结果表明，相对于野生酶，突变酶的γ-环糊精形成活力从14.1 U/mg降至1.3 U/mg，α和β-环糊精形成活力均有小幅度提高，其中，α-环糊精形成活力从0.4 U/mg升高至2.4 U/mg，而β-环糊精形成活力从2.5 U/mg升高至3.1 U/mg，但6个氨基酸的插入突变导致总的环化活力降低(表2)。

图4 野生型和突变体CGT酶的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the wild type and mutant CGTase. M: protein marker; 1: wild type supernatant fractionation; 2: wild type periplasmic fractionation; 3: wild type inclusion body; 4: mutant supernatant fractionation; 5: mutant periplasmic fractionation; 6: mutant inclusion body.

图5 纯化后野生型和突变CGT酶的SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the purification of wild type and mutant CGTase. M: protein marker; 1: wild type; 2: mutant.

2.3 突变体的最适温度和最适pH

为了确定酶转化的最佳反应条件，考察了突变体的最适温度和pH。如图6所示，野生型和突变体的最适温度均为 50 ℃，当温度升高至60 ℃时，突变体酶活下降较快，70 ℃时野生型酶活下降至原来的50%，突变体已基本失活。

与野生型相比，pH对突变体的影响不是很大 (图7)，在酸性条件下，突变体和野生型酶活都较低，碱性条件下，二者的酶活开始随pH的升高而增大，但突变体的最适pH为9，而野生型为10，pH为11时，野生型和突变体的活性都有所下降，但都可保持80%的活力。

表2 来源于B.clarkii 7364的野生和突变CGT酶的环糊精形成比活力Table 2 Cyclodextrin forming specific activities of the wild-type and mutant CGTases from B. clarkii 7364

图6 温度对野生型和突变体活力的影响Fig.6 Effect of temperature on the wild type and mutant γ-CGTase.

图7 pH对野生型和突变体活力的影响Fig.7 Effect of pH on the wild type and mutant γ-CGTase.

2.4 突变体的产物特异性

在野生酶和突变酶各自的最适温度和 pH下进行酶转化淀粉生产环糊精实验，从图 8可知，野生酶转化淀粉生产环糊精中α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精之比为1.2∶2.1∶10.5，其中γ-环糊精占 76%，α-环糊精、β-环糊精分别占8.7%和 15.2%。突变酶转化淀粉生产环糊精中α-环糊精、β-环糊精和 γ-环糊精之比为1.5∶2∶0.5，其中 γ-环糊精所占比例缩减为12.5%，α-环糊精、β-环糊精分别提高至37.5%和50%。突变酶γ-环糊精的产量降低，而α-环糊精和 β-环糊精的产量有所升高，与预期结果一致。但相对于野生酶，突变酶的总转化率从13.7 g/L降至4 g/L。

2.5 作用机理分析

在β-CGT酶中，γ-CGT酶所缺失的6个氨基酸位于底物结合沟槽的末端，与其他一些氨基酸残基共同构成了亚位点−7，与葡萄链末端的第9个葡萄糖残基结合相互作用，对其进行空间定位。在γ-CGT酶中添加这6个氨基酸，造成插入突变后，酶转化淀粉生成的环糊精中γ-环糊精所占比例明显降低。对比 β-CGT酶以及模拟的突变前后γ-CGT酶的晶体结构发现 (图9)，在亚位点−7处，β-CGT酶的环状结构较大，未突变前γ-CGT酶的环状结构较小，而添加6个氨基酸后，γ-CGT酶原来较小的环状结构变大，其空间走向与 β-CGT酶基本一致。进一步分析这种亚位点−7处环状结构的变化发现，突变前，γ-CGT酶较小的环状结构使得底物结合凹槽空间变大，从而为较长葡萄糖链的结合提供了足够的空间，因此这种构象更适合于大的γ-环糊精的生成。突变后，这6个氨基酸会与相应的葡萄糖残基相互作用，从而限制了葡萄糖链的结合，使得葡萄糖链结合的空间位阻变大，其所能结合的空间变小，从而限制了较长葡萄糖链的结合，因此这种构象不利于大的γ-环糊精的生成。

图8 野生型 (A) 和突变 (B) CGT酶分别作用于5% (W/V) 可溶性淀粉的环糊精形成过程Fig. 8 Courses of formation of CDs from 5% (W/V) soluble starch by wild-type and mutant CGTase, respectively. (A) Wild-type CGTase. (B) Mutant CGTase.

图9 β-CGT酶晶体结构 (红色) 与野生 γ-CGT酶(绿色) 和突变γ-CGT酶 (黄色) 模拟结构对比Fig. 9 Alignment of wild type (green) and mutant γ-CGTase (yellow) model structure with β-CGTase (red) crystal structure.

3 结论

本实验初步探讨了亚位点−7处的氨基酸残基对γ-CGTase酶产物特异性产生影响的规律和机理。在γ-CGT酶亚位点−7处中添加6个在α-、β-CGT酶中保守的氨基酸，造成突变酶转化淀粉生成的环糊精中 γ-环糊精所占的比例下降了63.5%，而 α-环糊精、β-环糊精分别提高了28.8%和 34.8%。由此确定 γ-CGT酶亚位点−7处氨基酸的缺失是其γ-环糊精形成的关键构象，并从其蛋白质的三维结构进行了一定的理论解释。这为进一步确定CGT酶的产物特异性与其结构的相关性，为进一步阐明CGT酶的催促反应机理奠定了基础，同时也为构建具有理想产物特异性的CGT酶突变体提供了依据。

REFERENCES

[1] Martin Del Valle EM. Cyclodextrins and their uses: a review. Process Biochem, 2004, 39(9): 1033−1046.

[2] Leemhuis H, Kelly RM, Dijkhuizen L. Engineering of cyclodextrin glucanotransferases and the impact for biotechnological applications. Appl Microbiol Biot, 2010, 85(4): 823−835.

[3] Jacob A, Rendleman J. Enhanced production of cyclomaltooctaose (γ-cyclodextrin) through selective complexation with C12 cyclic compounds. Carbohyd Res, 1992, 230: 343−359.

[4] Li ZF, Wang M, Wang F, et al. γ-Cyclodextrin: a review on enzymatic production and applications. Appl Microbiol Biot, 2007, 77(2): 245−255.

[5] van der Veen BA, Uitdehaag JCM, Dijkstra BW, et al. Engineering of cyclodextrin glycosyltransferase reaction and product specificity. Biochim Biophys Acta, 2000, 1543(2): 336−360.

[6] van der Veen BA. Engineering reaction and product specificity of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251[D]. Groningen: University of Groningen, 2000.

[7] Uitdehaag JCM, Mosi R, Kalk KH, et al. X-ray structures along the reaction pathway of cyclodextrin glycosyltransferase elucidate catalysis in the α-amylase family. Nat Struct Biol, 1999, 6(5): 432−436.

[8] Strokopytov B, Knegtel RM, Penninga D, et al. Structure of cyclodextrin glycosyltransferase complexed with a maltononaose inhibitor at 2.6 angstrom resolution. Implications for product specificity. Biochemistry, 1996, 35(13): 4241−4249.

[9] Uitdehaag JC, Kalk KH, van Der Veen BA, et al. The cyclization mechanism of cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) as revealed by a γ-cyclodextrin-CGTase complex at 1.8-A resolution. J Biol Chem, 1999, 274(49): 34868−34876.

[10] Dauter Z, Dauter M, Brzozowski AM, et al. X-ray structure of Novamyl, the five-domain "maltogenic" alpha-amylase from Bacillus stearothermophilus: maltose and acarbose complexes at 1.7A resolution. Biochemistry, 1999, 38(26): 8385−8392.

[11] van der Veen BA, Uitdehaag JC, Dijkstra BW, et al. The role of arginine 47 in the cyclization and coupling reactions of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251 implications for product inhibition and product specificity. Eur J Biochem, 2000, 267(12): 3432−3441.

[12] Kim YH, Bae KH, Kim, TJ, et al. Effect on product specificity of cyclodextrin glycosyltransferase by site-directed mutagenesis. Biochem Mol Biol Int, 1997, 41(2): 227−234.

[13] Parsiegla G., Schmidt AK, Schulz GE. Substrate binding to a cyclodextrin glycosyltransferase and mutations increasing the γ-cyclodextrin production. Eur J Biochem, 1998, 255(3): 710−717.

[14] Wind RD, Uitdehaag JC, Buitelaar RM, et al. Engineering of cyclodextrin product specificity and pH optima of the thermostable cyclodextrin glycosyltransferase from Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM1. J Biol Chem, 1998, 273(10): 5771−5779.

[15] Hirano K, Ishihara T, Ogasawara S, et al. Molecular cloning and characterization of a novel γ-CGTase from alkalophilic Bacillus sp. Appl Microbiol Biot, 2006, 70(2): 193−201.

[16] Penninga D, van der Veen BA, Knegtel RM, et al. The raw starch binding domain of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251. J Biol Chem, 1996, 271(51): 32777−32784.

[17] Sin KA, Nakamura A, Masaki Het al. Replacement of an amino acid residue of cyclodextrin glucanotransferase of Bacillus ohbensis doubles the production of γ-cyclodextrin. J Biotechnol, 1994, 32(3): 283−288.

[18] Penninga D, Strokopytov B, Rozeboom HJ, et al. Site-directed mutations in tyrosine 195 of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251 affect activity and product specificity. Biochemistry, 1995, 34(10): 3368−3376.

[19] Takada M, Nakagawa Y, Yamamoto M. Biochemical and genetic analyses of a novel γ-cyclodextrin glucanotransferase from an alkalophilic Bacillus clarkii 7364. J Biochem, 2003, 133(3): 317−324.

[20] Lejeune A, Sakaguchi K, Imanaka T. A spectrophotometric assay for the cyclization activity of cyclomaltohexaose (α-cyclodextrin) glucanotransferase. Anal Biochem, 1989, 181(1): 6−11.

[21] Mäkelä M, Korpela T, Laakso S. Colorimetric determination of beta-cyclodextrin: two assay modifications based on molecular complexation of phenolphtalein. J Biochem Bioph Meth, 1987, 14(2): 85−92.

[22] Kato T, Horikoshi K. Colorimetric determination of γ-cyclodextrin. Anal Chem, 1984, 56(9): 1738−1740.

[23] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 72(1): 248−254.

[24] Arnold K, Bordoli L, Kopp J, et al. The SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics, 2006, 22(2): 195−201.

[25] Kopp J, Schwede T. The SWISS-MODEL Repository of annotated three-dimensional protein structure homology models. Nucleic Acids Res, 2004, 32(Database issue): D230−D234.

[26] Schwede T, Kopp J, Guex N, et al. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Res, 2003, 31(13): 3381−3385.