陈晓玲 李照青 宋 敏，3 崔 巍 李栢林

（1中国医科大学基础医学院病理教研室，沈阳110001； 2北京大学人民医院内分泌科04级八年制研究生，北京100044；3中国医科大学附属第一医院病理科，沈阳110001； 4沈阳药科大学生命科学与生物制药学院药理系生理教研室，沈阳110016； 5中国医科大学基础医学院化学教研室 ，沈阳110001）

乳腺癌是女性一种常见的恶性肿瘤，在我国其发病率呈逐年上升趋势，淋巴结转移是乳腺癌早期和最常见的转移途径，也是影响乳腺癌患者预后的主要因素之一。因此，研究乳腺癌中与淋巴结转移相关的蛋白表达及其与各通路之间的关系十分重要。

泛素羧基末端水解酶L1（UCH-L1），属于泛素－蛋白酶体家族，参与泛素介导的蛋白质降解途径［1］。UCH-L1是一种去泛素化酶，作用于泛素化蛋白，通过水解泛素分子与底物蛋白的连接，阻碍底物蛋白的降解［2，3］。早期关于 UCH-L1的研究集中于它对神经组织﹑性别发育的作用。近年研究表明，UCH-L1的表达有严格的时间和空间特异性，异常表达常常与细胞的恶性转化和肿瘤的发生有关［4］。UCH-L1在多种肿瘤中高表达，但其在肿瘤转移中的研究相对较少。然而对UCH-L1功能的了解不是最终目的，真正弄清其下游作用因子，才有可能最终控制肿瘤的转移，这些与调控有关的分子都会成为治疗肿瘤转移的关键。

p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶MAPK家族的重要成员之一，多种细胞外刺激可使p38的丝氨酸和苏氨酸双磷酸化，从而使其激活。激活后的p38通过磷酸化转录因子引起多种相关基因转录、蛋白合成、细胞表面受体表达和细胞骨架结构改变，并参与肿瘤的侵袭和转移［5］。我们的前期研究表明，内源性p38MAPK的活性与乳腺癌细胞的侵袭能力相关［6］。

经研究发现，UCH-L1与p－pP38存在一定关系。在非小细胞肺癌中用RNA干扰抑制UCH-L1表达，能够抑制非小细胞肺癌体内外的转移，抑制p38的激活，减少 p－p38 的表达［7］。在乳 腺癌中UCH-L1的表达是否与肿瘤的分化程度以及侵袭转移有关，UCH-L1与p38之间调控关系如何，还仍需进一步研究。

材料和方法

1.材 料

组织：收集80例乳腺癌组织蜡块，取自于中国医科大学附属第一医院2002年1月至2008年5月手术切除标本。所有患者术前未经任何治疗。依据WHO2003年所推荐的乳腺癌组织学分类标准进行分类，80例乳腺癌组织均为乳腺浸润性导管癌（IDC），按 TNM 分期标准，I-II期48例，III-IV 期32例。有淋巴结转移33例，无淋巴结转移47例。收集上述80例乳腺癌组织蜡块，30例外科手术切除新鲜乳腺癌组织标本及其相应癌旁正常乳腺组织，标本取出后立即置-70℃冰冻保存。（80例乳腺癌组织蜡块中的30例分别与文中提及的30例新鲜乳腺癌标本属同一患者）

细胞系：一种乳腺正常上皮细胞系 MCF-10A和两种乳腺癌细胞系（MCF-7为低侵袭低转移癌细胞系、MDA-MB-435s为高侵袭高转移癌细胞系）原购自北京协和基础医学院细胞中心，本实验由已有的细胞复苏而得。

主要试剂：鼠抗人 UCH-L1单克隆抗体（sc-58593）购自SANTA CRUZ公司，鼠抗人p－p38单克隆抗体（＃9216）购自Cell signaling公司。UCH-L1抑制剂（＃662086）购自Merck公司。Transwell小室（孔径8um）购自Corning公司。

2.方 法

免疫组织化学技术检测乳腺癌石蜡标本中UCH-L1与p－p38蛋白的表达情况：80例标本经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，采用链霉素抗生物素蛋白－过氧化物酶法（Streptavidin-peroxidase，S-P）按说明书行免疫组化染色。UCH-L1稀释比例为1∶150，p－p38稀释比例为1∶200，以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性乳腺癌切片作阳性对照。

Western blot技术检测乳腺癌组织以及细胞系中UCH-L1与p－p38蛋白的表达情况：于4℃下取组织（细胞）标本1-2g，加约5倍湿重的裂解缓冲液，粉碎匀浆后，4℃静置，低温高速离心，提取上清即为总蛋白。经电泳、转印，5%正常小牛血清封闭，UCH-L1（1∶400）、p－p38（1∶400）和抗β-actin（1∶500）于4℃下孵育，过夜；于二抗中室温下孵育2h。ECL显色，X线胶片曝光成像，经自动电泳凝胶成像分析仪采集图像，每组结果均为相同条件下重复三次。

Transwell实验检测UCH-L1特异性抑制剂作用于MDA-MB-435s后，细胞侵袭潜能的变化：选取MDA-MB-435s细胞系，采用孔径为8μm 的24孔的Borden小室，上室加入1∶6Matrigel胶制成的人工基底膜，加入1×105个 MDA-MB-435s细胞，总体 积 200μl，并 加 入 终 浓 度 分 别 为 0、5、10、20μmol／L UCH-L1抑制剂。下室加入300μl含血清的培养液，每个药物浓度做3复孔，37℃培养24h后观察。用棉签擦掉基底膜上室面的细胞，下室用Giemsa染色。400×光镜下随机选择30个视野进行，取其平均数为穿膜细胞数。

3.统 计学分析

应用SPSS16.0统计软件行数据处理：采用χ2检验（不满条件时用Fisher确切概率法）分析计数资料，采用t检验分析Western Blot图像灰度值、transwell穿膜细胞数，用LSD-t检验对各样本均数行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.UCH-L1、p－p38在乳腺癌组织中的表达及其同临床病理参数的关系

本研究中，UCH-L1在80例IDC组织中阳性表达42例（52.5%），定位于细胞浆。p－p38在80例IDC组织中阳性表达46例（57.5%），主要定位于细胞核，少量定位于细胞浆（图1）。统计学分析显示，UCH-L1蛋白表达和p－p38蛋白表达呈正相关（r＝0.397，P＝0.000）（表1）。两蛋白的表达水平与IDC的TNM 分期（P＝0.017，P＝0.010）、淋巴结转移情况（P＝0.033，P＝0.021）相关，两者与患者年龄（P＝0.296，P＝0.585），肿瘤大小（P＝0.300，P＝0.161）无明显相关性（表2）。

图1 UCH-L1、p－p38在乳腺浸润性导管癌中的表达1A：UCH-L1胞浆 （＋）S-P×200；1B：UCH-L1胞浆 （＋）S-P×400；1C：p－p38胞核 （＋）S-P×200；1D：p－p38胞核（＋）S-P×400Fig.1The expression of UCH-L1protein and p－p38protein in breast infitrating ductal carcinoma issue1A：UCH-L1cytoplasm（＋）S－P×200；1B：UCH-L1cytoplasm （＋）S-P×400；1C：p－p38cell nucleus（＋）S-P×200；1D：p－p38cell nucleus（＋）S-P×400

表1 UCH-L1蛋白阳性表达与p－p38阳性表达的关系Table 1 The correlation between the expression of the UCH-L1protein and the p－p38protein

表2 UCH-L1、p－p38蛋白在石蜡标本中的表达与临床病理学参数的关系Table 2 The expression of UCH-L1protein and p－p38protein in paraffin-embedded specimens of breast cancer and their correlation with clinicopathological characteristics

新鲜乳腺组织 Western blot结果显示：参照DNA分子量标准，在乳腺浸润性导管癌可见在25KD﹑43KD附近有特异性条带，对应位置分别为UCH-L1﹑p－p38，而在癌旁正常乳腺组织中各条带均有不同程度的减弱（图2）。统计分析显示：UCH-L1﹑p－p38在乳腺浸润性导管癌组织中的表达高于癌旁正常乳腺组织（P＝0.012，P＝0.001），UCH-L1在III-IV期乳腺浸润性癌患者中高于I-II期患者（P＝0.014，P＝0.002）；在伴有淋巴结转移的乳腺癌组织中高于无淋巴结转移者（P＝0.016，P＝0.001）；但 UCH-L1和p－p38表达与患者的年龄、肿瘤大小无明显相关性（P＝0.753，P＝0.539；P＝0.723，P＝0.765）（表3）。

图2 UCH-L1和p－p38蛋白在乳腺浸润性导管癌和癌旁正常乳腺组织中的表达A1-A3代表癌旁正常乳腺组织，C1-C3代表乳腺浸润性导管癌组织，以β-actin为内参。Fig.2The expression of UCH-L1protein and p－p38 protein in breast infitrating ductal carcinoma issue and the normal breast tissue beside tumor

表3 UCH-L1和p－p38蛋白在乳腺新鲜组织中的表达及与临床病理学参数的关系Table 3 The expression of UCH-L1protein and p－p38protein in fresh tissue of breast cancer and their correlation with clinicopathological characteristics

2.UCH-L1、p－p38在乳腺细胞系中的表达

我们通过Western blot观察了乳腺正常上皮细胞系MCF-10A、乳腺癌低侵袭低转移细胞系MCF-7和高侵袭高转移乳腺癌细胞系 MDA-MB-435s中UCH-L1和 p－p38 的 表 达。 可 见 在 MCF-10A、MCF-7和 MDA-MB-435s中，UCH-L1和p－p38的表达逐渐升高。（图3）

3.UCH-L1的抑制剂作用于 MDA-MB-435s细胞系24小时后观察各指标改变

Western blot显示UCH-L1的抑制剂可以浓度依赖性地下调 MDA-MB-435s中 UCH-L1蛋白表达水平，而p－p38蛋白表达水平也随之减少（图4）。

Transwell实验检测细胞对人工重组基底膜的侵袭能力：400倍光镜下任意选取30个视野，进行计数，比较不同浓度的UCH-L1的抑制剂0、5、10、20μmol／L分别作用24h后的 MDA-MB-435s穿过人工基底膜的细胞数（个／视野），分别是：148.35±20.69、80.81±5.32、25.17±8.07、13.88±4.29，可见穿膜细胞数逐渐减少，行两两间比较P值均＜0.05（图5，表4）。UCH-L1的抑制剂能浓度依赖性地抑制乳腺癌细胞的侵袭转移潜能。

图3 UCH-L1和p－p38在 MCF-10A，MCF-7，MDA-MB-435s中的表达图4 UCH-L1抑制剂作用 MDA-MB-435s细胞系24小时后UCH-L1和p－p38的表达以β-actin为内参图5 UCH-L1抑制剂作用24h后，MDA-MB-435s细胞侵袭潜能的改变Fig.3The expression of UCH-L1protein and p－p38protein in cell lines of MCF-10A，MCF-7and MDA-MB-435s（β-actin as the internal reference）Fig.4The expression of UCH-L1protein and p－p38protein in MDA-MB-435scells treated with the specific inhibitor of UCH-L1after 24hour（β-actin as the internal reference）Fig.5The change of invasive potential of MDA-MB-435scells treated with the specific inhibitor of UCH-L1after 24hour5A：0μmol／L 5B：5μmol／L 5C：10μmol／L 5D ：20μmol／L（×400）

表4 穿过基底膜细胞数Table 4 The number of cells through the basement membrane

讨 论

肿瘤转移是恶性肿瘤的最重要标志，也是肿瘤所致患者死亡的最主要原因。它是由连续相关的多步骤组成的过程，肿瘤细胞通过不同途径，转移到不连续的远隔组织和器官，形成新的继发肿瘤灶。在这个过程中，不仅涉及抑癌基因失活和突变，还通过多种癌基因的异常表达，诱发和增强该肿瘤的转移潜能。

虽然UCH-L1为神经内分泌系统的一个特定的组织标记，而在另一些肿瘤研究中发现UCH-L1的高表达与肿瘤细胞密切相关，其可作为某些肿瘤的标记物。例如：甲状腺髓样癌经常误诊为甲状腺未分化癌，如果用UCH-L1作为检测甲状腺髓样癌的标记，大大增加对甲状腺髓样癌的确诊［8］。Otsuki T［9］等发现，UCH-L1在骨髓瘤里表达。在食道癌中UCH-L1也可以作为肿瘤的标记物［4］。在胰腺癌中也发现UCH-L1的过度表达和术后生存率显著性负相关。在研究中发现胃癌的分化程度与UCH-L1的表达密切相关，表明它可能参入肿瘤细胞基因的改变，从而调节细胞的生长周期［10］。

UCH-L1不仅与预后不良及细胞周期有关，还与肿瘤的侵袭转移有关。Hibi［11］等通过对非小细胞肺癌的研究，发现UCH-L1表达不仅与非小细胞肺癌发生、进展及预后有关，而且与其转移以及较强的侵袭潜力有关。认为UCH-L1的表达是不依赖神经内分泌而独立存在的和肺癌病理分期及预后相关的重要生物学指标，可能与肿瘤侵袭转移有关。另有研究发现，随着胃癌侵袭程度的加深、淋巴结的转移以及分化程度的增加，UCH-L1的阳性率逐渐上升，推测UCH-L1可能参与了胃癌的侵袭和转移过程并在其中发挥重要作用，可以作为分析肿瘤侵袭、转移以及分化程度的一个重要指标。UCH-L1阳性的胆囊腺癌进展快、生长速率高，易发生淋巴结转移及侵犯周围组织器官，UCH-L1是评估胆囊腺癌进展、生物学行为和预后的重要生物学标志物［12］。

实验显示UCH-L1在乳腺浸润性导管癌中表达高于癌旁正常乳腺组织，III期、IV期乳腺癌组织中的表达高于I期、II期乳腺癌，有淋巴结转移的乳腺癌中高于无淋巴结转移患者。结果表明其表达水平与浸润性导管癌的组织学分级，TNM分期、淋巴结转移情况相关。我们进一步分析了UCH-L1在乳腺癌细胞系中的表达情况，发现在乳腺正常上皮细胞MCF-10A、低侵袭低转移乳腺癌细胞系MCF-7和高侵袭高转移乳腺癌细胞系 MDA-MB-435s中，UCH-L1的表达逐渐升高。该结果进一步说明了UCH-L1可能与乳腺癌的侵袭相关。

我们推测在乳腺癌中，UCH-L1可能直接或间接阻碍了某些促癌基因的降解，激活某些信号通路，从而在乳腺癌的发生发展中起到重要的作用。p38受炎症因子和应激反应等多种细胞外刺激可使其丝氨酸和苏氨酸双磷酸化，从而被激活。p38激活后可使多种转录因子活化，影响细胞的转录［13］、蛋白合成、细胞表面受体表达和细胞骨架结构改变。并且，p38信号通路参与肿瘤的侵袭和转移，如介导肿瘤细胞粘附和运动［14，15］、细胞外基质降解［5，16］、肿瘤血管生成［17，18］、以及肿瘤细胞生长和增殖［19］。前期研究发现乳腺癌组织和细胞系中p－p38高表达，其和乳腺癌淋巴结转移相关［6］。

国外学者发现，UCH-L1与p38存在一定关系。非小细胞肺癌中用RNA干扰抑制UCH-L1的表达，能够抑制非小细胞肺癌的转移，并能够抑制p38的激活［7］。

我们进一步选取高侵袭高转移乳腺癌细胞系，应用UCH-L1抑制剂抑制UCH-L1的表达，发现细胞侵袭力下降，p－p38的表达也随之下降。推测UCH-L1可能抑制了某些促癌因素的降解，直接或间接激活了p38，促进乳腺癌的转移。

UCH-L1在肿瘤细胞的异常增殖、恶性转化及肿瘤细胞穿透基底膜侵袭周围组织和发生转移的过程中的作用机制尚不清楚，联合相关因子如癌基因、抑癌基因，探讨其对致癌基因、抑癌基因的影响可能会为阐明乳腺癌的转移途径提供新的思路。

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