邓春圣 王春芳 朱光君 李鹏飞 李京力

（1中国人民解放军第322医院 大同037006；2山西医科大学实验动物中心 太原030001）

脊髓损伤防治与再生修复是当今神经科学的重大难题和研究热点，神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）的发现，为脊髓损伤开拓了新天地，为其治疗和修复受损的脊髓运动神经元（motor neurons，MNs），提供了新的治疗途径［1，2］。本课题组与其他实验室均通过模拟体内MNs的分化途径将干细胞诱导分化为表达 MNs标记物的神经元［3，4］。这些研究仅是对干细胞诱导分化前后基因的表达变化进行了研究，而没有对诱导所得细胞与目的细胞间的差异进行分析。

目前对miRNA的研究已成为人们关注的热点，有报道显示，miR-126可以通过绑定到同源框来调控Hoxa9［5］，而Hox在脊髓运动神经元的发育过程中起着重要的作用［6］。miR-31是一种胚胎干细胞特异性的 miRNA［7］，同时我室研究人员也发现［8］，与运动神经元相比，miR-31在神经干细胞中高表达。就此，我们对NSCs诱导分化所得胆碱能神经元（运动神经元是胆碱能神经元的一种）和运动神经元中miR-126和miR-31的表达进行比较分析，以此了解两种细胞间的差别。

材料和方法

选取健康孕龄17d的Wistar大鼠（由山西医科大学实验动物中心提供），按本室前期的纯化方法，我们用免疫磁珠法分离获得运动神经元，并从剩余的细胞中培养获得神经干细胞［8，9］。并按照本室前期的诱导分化方法将神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元。分别收集诱导后所获得的胆碱能神经元和MNs。采用 mirVana miRNA Isolation Kit提取总RNA。

miR-126和miR-31表达的检测应用ABI公司的 TaqMan MicroRNA Assays real-time PCR 技术，该方法采用两步法：

第一步，采用 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit将总RNA逆转录为cDNA，逆转录反应体系为15μl中含：10ng总 RNA；3μl RT primer引物；7μl Master Mix（包含 dNTP mix；Multiscribe RT enzyme；10×RT buffer；RNase Inhibitor）。反应条件为：16℃30min，42℃1h，85℃5min。将所得cDNA于-20℃保存备用。

第二步，采用ABI公司设计的实时定量PCR引物，miR-126 （P／N：4373331；Applied Biosystems）和 miR-31 （P／N：4395339；Applied Biosys-tems）。PCR扩增体系为20μl中含：10μl 2×Taq－Man Gene Expression Master Mix；Real-time primer 1μl；cDNA 产物。在 ABI 7300型定量 PCR 仪上以下列条件进行扩增：95℃10min，95℃15s，60℃1min，循环40次。反应设置4个复孔，以4.5S RNA（P／N：4386736；Applied Biosystems）作为内对照。采用比较CT值法，应用RQ Study软件（Applied Biosystems）进行miRNAs的相对定量分析。

之后，我 们 采 用 PicTar（http：／／pictar.mdcberlin.de／）对 miR-126和 miR-31的靶基因进行预测分析，并通过Gene Ontology数据库检索，分别分析这些靶基因所参与的生物学途径。

结 果

1.m iR-126和miR-31在NSCs分化所得胆碱能神经元与MNs之间表达情况的比较

通过比较MNs和SCSCs诱导分化所得胆碱能神经元中miR-126和miR-31的表达情况，我们发现miR-126在胆碱能神经元中的表达是在MNs中的0.002倍（P＜0.05），miR-31在胆碱能神经元中的表达是在 MNs中的56.444倍（P＜0.05）（图1）。

图1 A miR-126在SCSCs诱导分化所得胆碱能神经元和MNs中的表达情况。图1B miR-31在SCSCs诱导分化所得胆碱能神经元和MNs中的表达情况。Fig.1AThe expression of miR-126in motor neurons and cholinergic neurons derived from SCSCs.Fig.1BThe expression of miR-31in motor neurons and cholinergic neurons derived from SCSCs.

2.m iR-126与miR-31预测靶基因及其参与的生物学过程

经pictar检索获得miR-126预测靶基因16个，miR-31预测靶基因181个，通过Gene Ontology数据库检索分析，发现在约25%的miR-126预测靶基因参与信号传导的调节（表1），16.57%的 miR-31预测靶基因参与发育过程（表2）。

表1 miR-126预测靶基因及其参与的生物学过程Table 1 The Predicted target genes of miR-126and their participated biological process

表2 miR-31预测靶基因及其参与的生物学过程Table 2 The Predicted target genes of miR-31and their participated biological process

讨 论

脊髓损伤是一种以损伤平面以下感觉、运动功能完全丧失和尿便失禁为主要临床表现的中枢神经系统的严重创伤性疾病，通常是由于交通、劳动和运动意外事故中常见的创伤类型，也是造成截瘫的主要原因和人类致残率最高的疾患之一。NSCs的发现为脊髓损伤的移植治疗提供了新的希望。音猬因子（Shh）和维甲酸（RA）是运动神经元在体内发育的关键因子［10，11］，Wichterle等通过模拟体内 MNs分化的途径，在体外用Shh和RA诱导鼠胚胎干细胞先向脊髓祖细胞分化，进而诱导脊髓祖细胞向运动神经元分化，最终20%-30%的细胞表达运动神经元的标记物Hb9［3］。此后几年中，也有实验室得出类似的实验结果［12，13］。近年来，本课题组联合应用Shh和RA，诱导脊髓源性NSCs，所得的细胞可表达胆碱乙酰转移酶（ChAT）［4］（ChAT 是运动神经元的重要标记之一）。

近年来，对细胞分化过程miRNA作用的研究成为人们关注的热点。有报道显示，miR-126可以通过绑定到同源框来调控Hoxa9［14］，而Hox在脊髓运动神经元的发育过程中起着重要的作用［15］，Hox与Shh（运动神经元在体内发育的关键因子）之间又存在着相互调控的关系［16］，由此推断，miR-126在运动神经元的发育过程中可能有着重要的调控作用。miR-31是一种胚胎干细胞特异性的miRNA［17］，同时本课题组也观察到miR-31在神经干细胞较运动神经元表达高的现象［10］，这显示miR-31可能在维持干细胞特性方面会起一定的作用。就此，我们在本实验中对miR-126和miR-31在运动神经元与神经干细胞分化所得胆碱能神经元间表达情况进行了比较分析。我们发现，miR-126在MNs中的表达较NSCs分化所得胆碱能神经元高，而miR-31的表达情况与miR-126相反。由此说明了诱导所得细胞与目的细胞之间在miRNA水平存在着差别，暗示着两种细胞在基因表达调控水平的差异。就此，我们对miR-126和miR－31的靶基因进行预测分析，并通过Gene Ontology数据库检索，分别分析这些靶基因所参与的生物学途径，结果显示，约25%的miR-126预测靶基因参与信号传导的调节，16.57%的miR-31预测靶基因参与发育过程，暗示两种细胞可能在信号传导和发育上存在有差别。同时，也提示miR-126和miR-31可以成为NSCs向MNs诱导分化过程中新的潜在作用靶标，通过在分化过程中对它们的表达进行干扰可以使诱导所得细胞与运动神经元之间差异逐步缩小，最终使神经干细胞更加有效地应用于脊髓损伤的治疗。

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