张 洁 左后娟 李 瑞 徐西振

（华中科技大学同济医学院附属同济医院高血压病研究所，武汉430030）

胰岛细胞凋亡导致的胰岛功能受损在2型糖尿病发生发展中的作用已经受到越来越多人的重视，而保护胰岛beta细胞避免凋亡从而治疗T2DM也成为1个崭新的治疗靶点［1，2］。雷诺嗪是一种新型抗局部缺血和心绞痛的药物，它能影响钠－钙平衡改善心肌缺血，减少慢性稳定型心绞痛的发作频率，增加运动耐量［3］。研究表明，雷诺嗪能降低2型糖尿病患者血糖含量，保护beta细胞功能［4］，然而雷诺嗪是否能抑制高糖高脂诱导的胰岛beta细胞的凋亡及通过什么途径抑制凋亡尚不清楚。因此，我们用雷诺嗪作用于胰岛beta细胞株NIT-1，观察它对胰岛细胞凋亡的作用并对相关机制进行探讨。

材料和方法

1.材 料

1.1 主要试剂

NIT-1细胞株（来源于转基因小鼠的胰岛beta细胞系），由本实验室保存。雷诺嗪购自美国CV Therapeutics公司。胎牛血清（FBS）和DMEM培养基购自Hyclone公司。Annexin V／PI凋亡检测试剂盒、MTT、牛血清白蛋白（BSA）、胰岛蛋白酶（Trypsin）购自武汉博士德生物工程有限公司。鼠胰岛素放射免疫测定试剂盒购自美国Linco公司。饱和脂肪酸－棕榈酸（PA）购自美国Sigma公司。兔抗人 Caspase-3抗体 （美国 Santa Cruze公司），PVDF膜 （美国Life Science公司），化学发光试剂ECL（Pirce公司）。

1.2 仪器

凝胶成像系统 Gene Genius Bio Imaging System为Synegene公司产品；微量紫外分光光度计为美国Bio-Rad公司；超净工作台（中国苏州）；CO2培养箱（Forma）。

2.方 法

2.1 细胞培养

将NIT-1胰岛beta细胞培养于含15%胎牛血清、1×105U／L 青 霉 素 和 100mg／L 链 霉 素 的DMEM低糖培养基中，细胞在37℃、5%CO2的环境中生长，取对数生长期的细胞用于实验。

2.2 实验分组

高糖高脂组加（PA 0.5mmol／L、glucose 25mmo／L和BSA 1.32%），治疗组（雷诺嗪组）加高糖高脂以及不同浓度的雷诺嗪；正常组加入等量DMEM。

2.3 细胞增殖实验

用胰酶消化培养瓶中处于对数生长期的细胞为单细胞悬液，以每孔1.0×104的密度接种于96孔板，每孔培养液体积为100μl，培养24h后吸出培养液，按上述分组给药，每浓度设4个复孔。实验结束后每孔加入10%CCK-81μl，在室温下静置1h后在自动酶标仪上测定每孔490nm处OD值。CCK-8与MTT类似，颜色深浅与细胞数目密切相关，细胞数目越多，颜色越深，在同体积同种类的细胞中，颜色深浅和细胞数目呈线性关系。

2.4 流式细胞仪检测凋亡

胰酶消化收集按上述分组处理24h的各组细胞，PBS冲洗2次，离心去上清，加500μl buffer重悬，每管加入含FITC标记的Annexin V 5μl和PI 5μl，室温避光作用5min后上机检测。

2.5 Western blot检测Cleaved caspase-3蛋白表达

将分组处理后的细胞用预冷的1×PBS洗2次，6孔细胞培养板三去污细胞裂解液（50mmol／L Tris-Hcl pH8.0，150mmol／L NaCl，0.02%NaN3，0.1%SDS，100μg／ml PMSF，1μg／ml Aprotinin，1%NP-40，0.5%去氧胆酸钠）150μl／孔 裂解细胞，Brandforad法测定细胞蛋白含量。每组取40μg蛋白质在12%SDS-PAGE凝胶上电泳分离，然后转移到PVDF膜上，1% 脱脂牛奶封闭2.5h，Caspase-3抗体孵育过夜，发光试剂ECL显影，曝光，并用凝胶成像分析系统灰度扫描定量蛋白质表达量，各组数据用beta-actin标准化处理。

2.6 统计学处理

实验结果数据均以¯x＋SE表示，Western blot的结果用凝胶成像分析系统测定蛋白条带的相对光密度值，每组实验重复3次。组间差异比较采用单因素方差分析，F检验，采用SPSS 12.0统计软件分析，P＜0.05为有统计学意义。

结 果

1.细 胞增殖能力分析

结果显示雷诺嗪对细胞的保护作用呈浓度依赖性，正常对照组（Normal）OD值为1.48＋0.045，高糖高脂组（Model）OD值为0.75＋0.05、高糖高脂＋0.1μmol／L 雷 诺 嗪 组 （Model＋0.1μmol／L Ranolazine）、高糖高脂＋1μmol／L雷诺嗪组 （Model＋1μmol／L Ranolazine）、高糖高脂＋5μmol／L雷诺嗪组 （Model＋5μmol／L Ranolazine）和高糖高脂＋10μmol／L雷诺嗪组 （Model＋10μmol／L Ranolazine）分别为1.03＋0.052、1.27＋0.041、1.41＋0.032和1.45＋0.06。结果显示高糖高脂组与正常组比较NIT-1细胞增殖能力明显下降（P＜0.05），而与不同浓度雷诺嗪共同作用后，细胞增殖能力随雷诺嗪浓度增加而逐渐增强，其中以5μmol／L组细胞增殖能力最强，之后增加雷诺嗪浓度不能有效促进细胞增殖。提示雷诺嗪对高糖高脂导致的细胞损伤有随浓度增加的保护作用（图1）。

图1 不同浓度的雷诺嗪对高糖高脂处理后NIT-1细胞增殖能力的影响Fig.1The effect of different concentration Ranolazine on the NIT-1cell proliferate ability.＊P＜0.05vs Normal group；＃P＜0.05vs Model group

2.A nnexin V／PI双标记检测细胞凋亡

细胞干预后通过流式细胞仪计数FITC＋／PI-的细胞即是早期凋亡的细胞。结果表明，高糖高脂组中FITC＋／PI-的细胞比例数目明显高于正常对照组组（P＜0.05），与雷诺嗪0.1μmol／L共同作用对细胞FITC＋／PI-比例无影响，但随浓度升高，FITC＋／PI-的细胞比例逐渐降低，以5μmol／L细胞保护作用最明显（P＜0.05）（表1）。

3.Cleaved caspase-3蛋白表达

Western blot法，并用beta-actin标准化处理，检测5μmol／L雷诺嗪作用后 Cleaved caspase-3蛋白表达量的变化。结果显示高糖高脂处理后相对于正常对照组Cleaved caspase-3显影条带明显增强（P＜0.05），用5μmol／L雷诺嗪共同作用24h后，条带强度明显减弱（P＜0.05）。内参beta-actin蛋白在各组的显影条带较为一致（图2）。正常对照组组、高糖高脂组和雷诺嗪组Cleaved-caspase-3的相对表达量比值A1分别为0.41＋0.07、2.48＋0.05和1.14＋0.02（图3）。

表1 雷诺嗪对高糖高脂处理后NIT-1细胞中FITC＋／PI的细胞比例影响Table 1 The ratio of FITC＋／PI-NIT-1cells among different groups（%.¯x＋SE＝5）

讨 论

胰岛素抵抗和胰岛细胞功能失调是2型糖尿病的主要发病因素，而胰岛beta细胞凋亡的增加在2型糖尿病的发生发展中也发挥着重要的作用，已有体外实验证明，高糖、高脂和炎性细胞因子等因素作用可促进胰岛beta细胞的凋亡［5－6］。实验选用与正常胰岛beta细胞无明显差异的NIT-1细胞进行体外培养，同时用与体内高糖高脂环境类似的高浓度的葡萄糖和饱和脂肪酸－棕榈酸作用于NIT-1细胞，模拟糖毒性和脂毒性，诱导NIT-1细胞的凋亡。结果显示高糖高脂联合作用24后，细胞凋亡率显著增加，提示高糖高脂对beta细胞凋亡有促进作用。如何保护胰岛beta细胞，并研究凋亡机制，是目前的重点。已有实验证明雷诺嗪能显著降低血液中糖化血红蛋白HbA1C的含量，并能保护胰岛beta细胞，促进胰岛素分泌，减低胰岛素抵抗，具有良好的临床应用前景［3－4］。但是，雷诺嗪对胰岛beta细胞的凋亡影响一直被人们忽视。本实验通过检测beta细胞凋亡，表明1.雷诺嗪对高糖高脂造成的beta细胞损伤具有随浓度增加的保护作用。2.这种保护作用在5μmol／L时最强。实验中还发现高糖高脂诱导的NIT-1凋亡伴随凋亡因子Caspase-3的活化片段Cleaved caspase-3的表达增加，提示Caspase-3的激活参与了NIT-1细胞凋亡损伤机制。Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3正是家族中的关键因子，它在凋亡信号传导的多种途径中发挥了重要的作用［7－8］。Caspase正常状态下以酶原的形式存在于细胞质中，在凋亡早期，被多种刺激因素激活，活化后的Caspase-3由2个大亚基和2个小亚基组成，裂解相应的细胞质胞核底物，最终导致细胞凋亡［9－10］。实验中5μmol／L雷诺嗪组Caspase-3活化片段的表达较高糖高脂组减少，表明雷诺嗪在抑制细胞凋亡同时减少凋亡因子Caspase-3的激活，提示雷诺嗪对NIT-1细胞保护作用与Caspase-3活化有关。

由以上实验可知，Caspase-3在高糖高脂联合作用导致的胰岛beta细胞凋亡中发挥重要作用，进一步的研究证明了雷诺嗪beta细胞的保护作用与Caspase-3的活化有关，揭示了雷诺嗪保护作用的分子机制，为2型糖尿病的治疗和胰岛细胞损伤的保护提供了新的方向。

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