刘 健 万 磊 程园园 冯云霞 刘 磊 黄传兵 汪 元

(安徽中医学院第一附属医院风湿免疫科，合肥230031)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性、持续性、对称性关节炎为特征的全身自身免疫性疾病，其病理表现主要有滑膜炎、血管炎等，常常侵及到滑膜、软骨和骨质，导致出现滑膜增生、软骨吸收和骨质破坏，还可以累及到全身各个脏器。肺中的血管和结缔组织丰富，所以肺部受累几率更高。RA累及到肺组织的主要表现为肺间质纤维化、胸膜病变、肺内结节、Caplan综合征等，其中最常见的为肺间质纤维化。肺间质纤维化病变不可逆，严重影响RA患者的生活质量［1-3］。RA的发生发展与免疫细胞网络失衡密切相关，实验研究表明，佐剂关节炎(Adjuvant arthritis，AA)大鼠肺功能明显降低，且肺功能参数与肺组织高分辨率CT、细胞因子呈高度相关［4，5］。最新研究发现，Notch信号传导通路不仅调控免疫细胞谱系的产生，还可以通过参与调节外周成熟免疫细胞的进一步分化而发挥作用［6，7］。而RA的发生也是免疫细胞不断分化的过程，因此，可以推测Notch信号通路可能参与RA及RA引起肺病变的发病过程。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级(SPF)雄性SD大鼠20只，鼠龄6～7月，体质量为(180～200)g，由南京医科大学实验动物中心提供。清洁级标准饲养，并给予充足的水份和食物，供试前在清洁动物房常规饲养7天，观察无异常者入组实验。

1.2试剂与仪器

1.2.1主要试剂 弗氏完全佐剂(CFA)，美国Sigma公司出品(批号：098k8729);异硫氢酸荧光素(FITC)标记的抗鼠CD4单抗，购自美国e-Bioscience公司(批号：11-0040)、藻红蛋白(PE)标记的抗鼠CD25单抗，购自美国Bio-Legend公司(批号：202105);逆转录试剂盒(M-Mulv Reverse，批号：00076653)、PCR 扩增试剂盒(PCR Master Mix，批号：00077926)，购自加拿大Fermentas公司;Notch受体及配体引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.2主要仪器 动物肺功能分析系统，北京贝兰博科技有限公司生产(AniRes2003)。高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司(Centrifuge 5417R);紫外可见分光光度计，日本 SHIMADZU 公司(UV2401PC);PCR扩增仪，德国Biometra公司(TGradient Thermoblock);电泳仪，美国Amersham公司(EPS-301);凝胶图像分析仪，美国 Bio-Rad公司(Gel Doc XR);流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司(Epics XL)。

1.3模型复制 将20只SD大鼠随机分为2组：正常对照组(NC)，模型对照组(MC)，每组10只。向MC组每只动物右后足跖皮内注射CFA 0.1 ml，复制成AA模型［8］。致炎18天后用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉(0.35 ml/100 g，v/m)，将大鼠气管切成“T”字状，气管插管，检测两组大鼠肺功能;静脉采血，4小时内采用流式细胞仪检测大鼠外周血调节性T细胞(Treg);打开胸腔取出肺脏，完整分离出气管和双肺，去除周围结缔组织，取右肺中叶置于福尔马林(10%)固定，备用;取大鼠左肺组织［约(100±20)mg］装入冻存管中，置液氮中备用。

1.4主要指标

1.4.1足跖肿胀度、关节炎指数的测算 足跖肿胀度：分别在造模前1天、致炎后第18天测量各组大鼠后足跖的容积，计算各组大鼠足跖肿胀度［9］，肿胀度：E(%)=(Vt-Vn)/Vn×100%(Vn、Vt分别代表造模前后的容积)。关节炎指数：致炎后开始观察并记录全身关节病变情况，每3天1次。全身病变按5级评分法评价，根据未注射佐剂的其余3只肢体的病变程度累积积分，计算出AI［10］。0分：无红肿;1分：小趾关节红肿;2分：趾关节和足跖肿胀;3分：踝关节以下的足爪肿胀;4分：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。累计计算各个关节的积分。

1.4.2肺功能测定 致炎18天后，用小动物肺功能仪测定肺功能。测定指标：1秒内平均呼气流量(FEV1/FVC%)、25%肺活量的最大呼气流量(FEF25)、50%肺活量的最大呼气流量(FEF50)、75%肺活量的最大呼气流量(FEF75)、用力最大呼气流量(PEF)、肺动态顺应性(Cldyn)。操作过程：10%水合氯醛(0.35 ml/100 g，v/m)腹腔注射麻醉，气管切开行气管插管，将大鼠置于体描箱内，与呼吸机相连，机械通气测肺功能。

1.4.3肺组织病理形态学观察 将肺组织于10%福尔马林固定8小时后，依次予脱水、透明、浸蜡和包埋，切片(6 μm)作HE染色。肺泡炎程度：无肺泡炎(-);轻度肺泡炎(+)：肺泡隔因细胞浸润增宽，病变范围局限在全肺的20%以下;中度肺泡炎(++)：病变范围占全肺的20% ～50%;重度肺泡炎(+++)：呈弥漫性分布，病变范围大于50%;分别记为 0、1、2、3 分［11］。

1.4.4流式细胞术检测大鼠外周血Treg 取大鼠新鲜血液置于肝素钠采血管，按每106个细胞/管分别加入 CD4-FITC 0.25 μg、CD25-PE 1.0 μg，室温避光20～30分钟;加红细胞裂解液1 ml，避光15～25分钟;用PBA洗两遍，离心弃上清，加500 μl PBA，上流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg占CD4+比例。

1.4.5RT-PCR法检测肺组织Notch配体及受体

引物的设计与合成：根据 Gene-Bank提供的Notch1mRNA 序列(NM_001105721)、Notch2mRNA序列(NM_024358)、Notch3mRNA序列(NM_020087)、Notch4mRNA 序列(NM_001002827)和Jagged1mRNA序列(NM_019147)、Jagged2mRNA序列(XM_001073124)、Delta1mRNA序列(NM_032063)。使用Primer Premier 5软件设计并分析引物。引物序列见表1。PCR反应：以GAPDH作为内部参考，每组样品具有相同的cDNA样本和相同的PCR扩增条件，反应条件为95℃预变性5分钟，然后进行35个循环的反应，每一循环包括变性(94℃)30秒，退火(Jagged1：56℃、Jagged2：56℃、Delta1：58℃、Notch1：54℃、Notch2：55℃、Notch3：58℃、Notch4：57℃、DAPDH：60℃)40秒，延伸(72℃)60秒，最后72℃延伸10分钟，4℃终止;扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶(含0.1 μg/ml溴化乙啶)中进行电泳，电压为90伏，时间为65分钟;凝胶扫描仪扫描溴化乙啶染色后的凝胶。利用Bio-Rad凝胶图像分析仪进行照相，采用Image-Pro Plus软件对条带进行分析，计算电泳条带光密度(IOD)，以 Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jagged1、Jagged2、Delta1与GAPDH 的IOD比值作为表达的相对含量。

1.5统计分学析 采用SPSS11.5软件包进行统计学处理，实验数据为连续性变量用±s表示，样本均采用正态性检验;NC组与MC组的足跖肿胀度、关节炎指数、肺泡炎积分、肺功能及Treg、Notch mRNA光密度值等比较，采用独立样本t检验;相关性分析采用多元相关及多元逐步回归分析，检验水准为0.05。

2 结果

2.1AA大鼠足跖肿胀度、关节炎指数的变化 致炎前两组大鼠足跖肿胀度、关节炎指数无差异;模型复制后，致炎6小时，MC组大鼠右后足趾开始出现红肿，致炎第3天，MC组大鼠足跖肿胀度达最高峰，后逐渐下降，第4、5天部分双前足趾开始出现红肿，致炎12天关节炎指数达高峰，后逐渐下降。见图 1、2。

2.2AA大鼠肺功能参数的比较 模型复制第18天，与NC组相比，MC组肺功能参数 FEF75、PEF、Cldyn明显降低;FEV1/FVC%明显升高(P＜0.01)，FEF25、FEF50两组比较无显著意义(P＞0.05)。见表2。

2.3AA大鼠肺组织的形态学改变 光镜观察：NC组大鼠肺组织结构清晰，未出现明显形态学改变;MC组大鼠肺泡结构破坏，肺泡变大、变形，部分呈肺实变，肺泡腔及肺间质内有大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主，并且有少量巨噬细胞浸润;肺泡壁局部增厚，肺间隔明显增宽，部分肺泡腔内有不同程度的出血、水肿;偶见成纤维细胞增殖，胶原纤维结缔组织沉积，见图3、4。依据Szapiel确定的肺泡炎积分较NC组明显增加，(P＜0.01)，见表 2。

表1 Notch受体、配体引物序列及预扩增长度Tab．1 Primer sequences and pre-expansion growth of Notch receptor and ligand

2.4AA大鼠外周血Treg及肺组织Notch受体、配体mRNA的表达 与NC组比较，MC组Notch3、Notch4、Delta1的表达水平明显升高(P＜0．05或P＜0.01)，Notch2的表达升高，但无统计学意义(P＞0.05);Notch1、Jagged1、Jagged2 及 CD4+CD25+Treg的表达明显降低(P＜0.01)。见表3，图4。

图1 各组大鼠足趾肿胀度的比较Fig．1 Comparison of paw swelling degree in rats

图2 各组大鼠关节炎指数的比较Fig．2 Comparison of arthritis index in rats

表2 2组肺泡炎积分、肺功能比较(n=10，±s)Tab．2 Comparison of alveolitis points，lung function in two groups(n=10，±s)

表2 2组肺泡炎积分、肺功能比较(n=10，±s)Tab．2 Comparison of alveolitis points，lung function in two groups(n=10，±s)

Note：Compared with the NC group，1)P＜0.01，2)P＜0.05.

Index NC group MC group Alveolitis points(points) 0.42±0.61 2.21±0.971)Lung function parameter FEV1/FVC(%) 57.70±5.79 68.60±6.381)FEF25(ml/s) 42.30±10.10 38.90±12.80 FEF50(ml/s) 39.80±9.88 34.70±7.29 FEF75(ml/s) 36.40±8.57 26.40±9.611)PEF(ml/s) 40.10±6.89 31.10±5.571)Cldyn 0.37±0.21 0.24±0.162)

表3 各组大鼠Notch受体、配体及CD4+CD25+调节性T细胞的比较(n=10，±s)Tab．3 Comparison of Notch receptors，ligands，and CD4+CD25+regulatory T cells of lung tissue in rats(n=10，±s)

表3 各组大鼠Notch受体、配体及CD4+CD25+调节性T细胞的比较(n=10，±s)Tab．3 Comparison of Notch receptors，ligands，and CD4+CD25+regulatory T cells of lung tissue in rats(n=10，±s)

Note：Compared with the NC group，1)P＜0.01，2)P＜0.05.

NC groups MC groups Jagged1mRNA 0.58±0.22 0.33±0.141)Jagged2mRNA 0.56±0.34 0.40±0.211)Delta1mRNA 0.49±0.18 0.65±0.341)Notch1mRNA 0.67±0.25 0.42±0.191)Notch2mRNA 0.52±0.31 0.54±0.22 Notch3mRNA 0.43±0.16 0.62±0.391)Notch4mRNA 0.41±0.18 0.54±0.252)CD4+CD25+Treg 8.65±2.86 5.12±3.151)

图3 各组大鼠肺组织形态学变化(HE染色，×200)Fig．3 Morphology of lung tissue in rats(stained with HE，×200)

图4 各组大鼠Notch受体、配体表达Fig．4 Expression of Notch receptor and ligands mRNA of lung tissue in rats

表4 AA大鼠肺功能参数与CD4+CD25+Treg、Notch受体、配体指标的相关性分析(r)Tab．4 Correlation between lung function parameter and CD4+CD25+Treg，Notch receptor，ligand in AA rats(r)

2.5相关性分析 Spearman相关分析结果显示，AA大鼠肺功能参数FVC、FEF75与CD4+CD25+Treg呈正相关，FEF50、MMF与 Jagged1、Notch1呈正相关;FEF25、FEF50、PEF 与 Delta1、Notch3、Notch4 呈负相关(P＜0.01或P＜0.05)，见表4。

3 讨论

RA常表现为外周关节的滑膜炎，还可以侵及全身其他的组织和脏器，肺组织因为含有丰富的结缔组织和血液供应，肺部最常受累。肺间质病变是RA累及肺部最常见的病变，与其他风湿病比较，RA侵及肺部的特点多位于肺基底部。Taichman等［12］研究表明，Notch信号在肺损害中起重要作用，Notch信号通路可以通过介导转录因子的表达，对肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的增殖、分化、迁移、成熟等有着调控作用。同时，调节性T细胞也可能参与其发病过程，研究发现，RA患者外周血中调节性T细胞的表达明显降低，同时与RA的肺功能呈正相关;调节性T细胞调控作用的降低导致关节局部或肺组织免疫复合物的形成和沉积［13］，从而激活信号传导通道。免疫复合物的形成和沉积过程是RA发病的基础，活化的转录因子调控一系列炎性反应相关因子的表达，形成瀑布级联放大的效应，共同参与肺损伤过程［14，15］。

本组实验研究显示，AA大鼠足趾肿胀度、AI升高的同时，其肺功能参数指标如 FEF75、PEF、Cldyn降低，而反映肺组织炎症的肺泡炎积分呈升高趋势，这说明大鼠在CFA致炎后，引起关节局部炎症浸润的同时，肺组织也同样受累，肺功能呈降低趋势，肺功能损害表现在通气功能障碍，以限制性通气功能障碍为主，肺的顺应性降低，这与我们先前研究相符［16］。同时我们研究发现AA大鼠肺Cldyn降低，提示RA在未发生间质纤维化等严重结局时，即已出现肺组织的动态顺应性、肺容积降低，阻碍气体进一步交换，损伤肺功能。通过对AA大鼠外周血中的Treg检测发现，CD4+CD25+Treg表达较正常组明显降低，这与我们临床的研究结果一致［17］。而进一步检测肺组织的Notch受体和配体，我们发现，AA大鼠肺组织中的Notch3、Notch4及Delta1的表达水平明显升高，而Notch1、Jagged1、Jagged2的表达水平显著降低，说明Notch信号传导通路可能参与了肺功能降低的过程;同时相关分析可知，AA大鼠外周血中CD4+CD25+Treg与Jagged1、Notch1呈正相关，与Delta1、Notch4呈负相关，AA大鼠肺功能降低可能与Treg调节Notch信号传导途径有关，二者共同参与肺功能损伤的过程。可能是AA大鼠在致炎后，沉积于关节和肺等组织局部的免疫复合物没有及时清除，导致 Notch信号通路的激活，Notch受体与配体结合作用于邻近细胞，进一步参与T细胞的增殖、活化，从而导致肺功能的降低。

Notch是一个跨膜受体蛋白家族，它是通过Notch配体与受体的相互作用而转导信号，能够调控细胞的增殖和分化，对生物体的细胞增殖、分化和凋亡起着重要的作用。Notch受体有四种，分别为Notch1、Notch2、Notch3、Notch4 等，配体有五种，包括Delta1、Delta3、Delta4、Jagged1 和 Jagged2 等，相邻细胞可以通过Notch配体与受体的结合传递Notch信号，从而扩大、固化细胞间的分子差异，最终决定生物体细胞的归属［18］。配体在T细胞、抗原提呈细胞(APC)表面均有表达，通过与受体结合而触发信号通路转导，从而调控各细胞谱系的发育和成熟［19］。在免疫系统中，Notch信号途径不仅调控T、B细胞谱系的产生，还参与调节外周成熟T细胞及其亚群的分化和功能发挥［20］。T细胞在胸腺内发育过程中通过凋亡进行克隆清除，绝大多数胸腺细胞通过凋亡而消失，仅少部分发育成熟，这对机体免疫应答系统的建立十分重要［21］。研究发现配体Delta1与受体Notch的相互作用是决定T淋巴细胞定向分化的关键［22］。当Notch1活性受抑时，干细胞进入分化程序，发育成终末功能细胞。而Notch3的表达增高可抑制此过程，使前体细胞维持在未分化状态［23］，这就决定了细胞的分化程度。本组研究显示AA大鼠肺组织中 Jagged1、Jagged2表达下调，而CD4+CD25+调节性T细胞出现下降，提示Notch配体中的Jagged1能抑制细胞的成熟，并通过抑制T淋巴细胞分化，不能诱导免疫耐受，同时Delta1表达下调说明Delta1和Jagged均可以竞争性的抑制T细胞分化。Notch3和Notch4表达升高、Notch1表达降低提示在免疫复合物的刺激下，Notch3、Notch4与其配体Delta1结合可能诱导CD4+T细胞向Th1细胞分化，从而出现CD4+CD25+T细胞表达降低，导致细胞免疫功能紊乱而出现AA大鼠肺功能降低。

综上所述，RA致肺功能降低发病具体过程环节极为复杂，Notch通路中受体与其他配体，如Delta3、Delta4是如何对免疫细胞的调节机制还需进一步研究。

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