周鹤峰 邵 敏 于立强 葛正龙 (遵义医学院珠海校区生物工程系，珠海519041)

阪崎肠杆菌(Enterobacter Sakazakii，ES)是一种周生鞭毛、革兰氏阴性无芽胞杆菌，为肠道正常菌群中的一种，属条件致病菌，新生儿特别是早产儿和免疫力低下的人容易导致脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎，幸存者也容易导致神经系统后遗症，死亡率高达20% ～50%［1］。近年来，阪崎肠杆菌感染事件国内外相继报道，已引起世界各国重视，其中较多的是婴儿配方奶粉污染［2，3］。目前，ES检测主要依赖传统细菌学分离培养方法、分子生物学等检测手段［4］，我国于2005年颁布了ES分离与计数检验的行业标准，但上述方法都存在检测周期长、操作繁琐等缺点，因此需要建立简便快速、特异性强、灵敏度高的检测手段。

国内外尚未有关于制备阪崎肠杆菌单克隆抗体并应用ELISA快速检测试剂盒对ES进行检测的报道。本研究利用杂交瘤技术制备出能稳定分泌抗ES的单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)的细胞株，为今后阪崎肠杆菌快速检测试剂盒的研制奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1材料 6周龄雌性BALB/c小鼠，体重18～20克，广东省医学实验动物中心;小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)，中国武汉典型培养物保藏中心;阪崎肠杆菌，广东环凯微生物科技有限公司;PEG1000、HAT、HT、TMB为 Sigma公司产品;DMEM、胎牛血清为Gibco公司产品;mAb亚类检测试剂盒、羊抗小鼠IgG-HRP为武汉博士德公司产品;细胞培养板、96孔酶标板Corning公司产品;其它试剂均为进口或国产分析纯。

1.2动物免疫 阪崎肠杆菌离心后菌体加1%的甲醛灭活过夜，生理盐水洗涤，用PBS稀释至2×108CFU/ml作为免疫原。将菌体与弗氏完全佐剂等体积乳化混匀，按0.5 ml/只菌液量(1×108CFU/ml)腹腔免疫BALB/c小鼠，首次免疫后，于第14、28、42天分别加强免疫三次，间接ELISA法检测血清效价，以未免疫小鼠血清作为阴性对照，以P/N≥2.1判定为阳性，且最大抗血清稀释倍数为该血清的效价，超过1∶10 000效价的BALB/c小鼠用于融合。融合前3天，取0.1 ml菌液尾静脉注射加强免疫。

1.3细胞融合 取免疫小鼠脾细胞和SP2/0，融合剂为PEG1000，按常规操作方法进行。用未免疫小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，融合后的细胞在含HAT培养基、5%CO2培养箱中37℃选择培养。

1.4阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆［5］以灭活的菌体作为包被抗原，对细胞上清采用间接ELISA进行检测，筛选分泌阳性抗体的杂交瘤细胞，以细胞融合的免疫小鼠血清作阳性对照，以SP2/0的培养上清与正常BALB/c小鼠血清作为阴性对照。对阳性细胞株中OD450值高且细胞生长状态好的采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆2～3次后对所有孔均为阳性且能稳定分泌抗体的细胞株进行扩大培养，液氮冻存。

1.5mAb腹水的制备 将8周龄BALB/c小鼠每只腹腔注射0.5 ml液体石蜡，7天后以1×106个/0.5 ml杂交瘤细胞注射BALB/c小鼠，待小鼠腹部明显膨大，收集腹水，3 000 r/min离心5分钟取上清，分装，保存备用。

1.6单克隆抗体特异性测定 用灭活的菌体作为抗原包被96孔酶标板，封闭后，采用间接ELISA法，设置空白、阳性对照，mAb分别和13种不同菌株进行交叉反应试验，交叉反应越少，表明特异性越强。

1.7细胞培养上清液和腹水效价测定 采用间接ELISA方法，以SP2/0的培养上清为阴性对照，测定培养上清和腹水的抗体效价。

1.8单克隆抗体亚类鉴定 按照mAb亚类检测试剂盒说明书进行操作。

1.9亲和力的测定 以不同稀释度的菌体抗原包被96孔板，间接ELISA法检测相应的OD值，以不同浓度mAb对数值为横坐标，以其相应的OD值为纵坐标，绘制出测定曲线，以各曲线上部趋于平坦段的OD值为100%，查出其OD值为50%时的mAb浓度，根据公式计算每株mAb的亲和力常数［6］。

1.10染色体分析 采用秋水仙素阻抑法对杂交瘤细胞的染色体进行分析。将筛选得到的杂交瘤细胞扩大培养，用秋水仙素处理，制备有丝分裂中期细胞，操作步骤按说明书进行，Giemsa染色后观察，每个细胞株观察100个完整的中期核细胞，计数杂交瘤细胞的染色体数目。

1.11Western blot鉴定 按常规操作方法，将腹水使用饱和硫酸铵粗提蛋白，并适当浓缩。菌体蛋白经SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜上，以纯化的mAb为一抗，羊抗小鼠IgG-HRP为二抗，进行免疫印迹分析。

2 结果

图1 杂交瘤细胞株Fig．1 Hybridoma cell lines

2.1杂交瘤细胞株的筛选和亚克隆 杂交瘤细胞株建立过程中共进行2次融合，融合率在90%以上。细胞融合7～10天后，杂交瘤细胞克隆生长至肉眼可见时，采用间接ELISA对其进行检测，筛选出效价高，细胞团相对较少的细胞孔进行三次以上亚克隆。细胞融合和亚克隆如图1，细胞融合时，在HAT选择培养下，一些未融合或自身融合的细胞死亡，背景杂乱，经亚克隆培养后，可见背景相对清晰，单个克隆生长。经筛选和检测获得5株能稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株，分别命名为：1H7、2H9、2B12、4H4、5A5。

表1 单克隆抗体交叉反应结果Tab．1 Cross reactivity result of mAb

表2 杂交瘤细胞株培养上清和腹水抗体效价Tab．2 Antibody titer in supernatant and ascites

2.2单克隆抗体特异性鉴定 选择阪崎肠杆菌同属的阴沟肠杆菌、产气肠杆菌以及常见的食源性致病菌等共13种菌进行交叉反应试验，见表1，2H9能与阴沟肠杆菌出现阳性反应，而与阪崎肠杆菌反应阴性。4H4、5A5也分别与其他几种菌体发生交叉反应。结果表明，1H7、2B12具有良好的特异性。

2.3细胞培养上清液和腹水效价测定 分别收集阳性杂交瘤细胞培养上清和腹水，按10倍梯度稀释，间接ELISA方法检测效价，以P/N值≥2.1时的最高稀释倍数为此单抗的效价，结果如表2。

2.4单克隆抗体亚类鉴定及亲和力的测定 采用抗体亚类试剂盒测定，1H7和2B12产生的单抗的抗体Ig亚类分别为IgG1和IgG2a。间接ELISA法测定mAb的相对亲和常数分别为1.23×109L/mol和2.68×109L/mol，显示制备的单抗与阪崎肠杆菌的亲和力高。

2.5染色体分析 正常小鼠脾细胞染色体数目为40条，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62～68条，两株杂交瘤细胞株染色体数目分别为104和106条，如图2所示，表明杂交瘤细胞确为两个亲本细胞融合后产生。

图2 杂交瘤细胞的染色体分析(Giemsa，×1 000)Fig．2 Chromosome number of hybridoma cells(Giemsa，×1 000)

图3 单抗的Western blot分析Fig．3 Western blot analysis of mAb

2.6单克隆抗体的特异性检测 Western blot分析结果表明，两株mAb能与阪崎肠杆菌的菌体总蛋白发生特异性结合，说明其具有良好的特异性。

3 讨论

阪崎肠杆菌是近几年在乳制品中新发现的一种致病菌，已引起世界各国重视，但由于对其致病机理、免疫反应、基因结构等方面研究尚不清楚，因此，阪崎肠杆菌检测方法仅为传统的细菌分离培养方法、分子生物学等手段［7-9］，用胶体金检测技术和酶联免疫吸附法等免疫学检测手段国内外尚未见报道。我国于2005年在《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》GB 4789.40-2010中规定了阪崎肠杆菌改进的传统检测方法、普通PCR方法和荧光PCR方法，近年一些研究学者相继研究了 LAMP法［10］、TaqMan PCR［11］检测法等改进方法，但在单克隆抗体技术基础上建立ELISA和胶体金检测法目前尚未见报道。

本试验以1%的甲醛灭活的阪崎肠杆菌为免疫原对小鼠进行免疫注射，其中灭活时间要大于16小时，低于16小时菌体尚未完全灭活，腹腔注射后对小鼠产生毒性，造成小鼠大量死亡，培养可见细菌增长。经过多次摸索细胞融合过程中免疫脾细胞和骨髓瘤细胞数目比、融合时间、操作手法等，使融合率提高至90%以上，孙慧慧等［12］曾报道使用PEG1000能实现较高融合率，本实验使用融合剂为PEG1000也验证这点，试验中也曾使用PEG4000，但融合率低于50%，由于PEG的相对分子质量越大、体积分数越高、作用时间越长、对细胞毒性越大［13］。

实验经三次以上亚克隆，获得5株阳性杂交瘤细胞株。阪崎肠杆菌为肠杆菌科肠杆菌属的一种，其产生的抗体特异性决定单抗的应用价值，因此，在对5株阳性杂交瘤细胞株进行交叉反应实验过程中，选择同属的阴沟肠杆菌、产气肠杆菌进行检测，结果表明，2H9、4H4能与阴沟肠杆菌发生阳性反应，另选择与阪崎肠杆菌同为常见的食源性致病菌进行检测，5A5与大肠杆菌O157：H7产生交叉反应;同时，抗体的稳定性也是抗体分泌能力的关键因素，mAb2H9经多次传代进行交叉反应时与阪崎肠杆菌产生阴性反应，证明其不能稳定分泌抗体。最后，经特异性筛选得到能稳定分泌抗体的两株阳性杂交瘤细胞株。

本实验所获得的两株阳性杂交瘤细胞株产生的单抗分别为IgG1和IgG2a亚类且效价相对较高，经Western blot鉴定，能与阪崎肠杆菌菌体蛋白特异性结合。该单克隆抗体的成功制备，为阪崎肠杆菌胶体金检测试剂盒和ELISA快速检测试剂盒的制备奠定了基础。

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