刘倩，郑国华，程璐，张耕

(1.湖北中医药大学药学院，武汉 430065;2.武汉市第一医院制剂中心，430022)

咽舒饮合剂是武汉市第一医院的医院制剂(批准文号:鄂药制字Z20082959)，由金银花、石斛、玄参、淡竹叶、薄荷、射干、麦冬、青果、甘草9味药材组成，主要功效为清热解毒，利咽润喉，临床上用于治疗急慢性咽炎，干燥性咽炎。本制剂为口服制剂，根据其用药途径，应进行细菌、真菌和酵母菌的测定及大肠埃希菌的检查。根据《中华人民共和国药典》2010年版一部微生物限度检查法规定［1］，应进行细菌、真菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、真菌及酵母菌数的测定和控制菌的检查。笔者查阅有关文献［2-3］，并进行多次实验，确定咽舒饮合剂微生物限度的检查方法，更进一步保证了该制剂的质量。

1 仪器与材料

1.1 仪器 SW-CJ-ICU型标准型净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司);BP2100电子天平(赛多利斯);LRH-150-Ⅱ型生化培养箱(广东省医疗器械厂);PYX-DHS细菌培养箱(上海市医疗器械一厂);HR40-IIA2生物安全柜(青岛海尔特种电器有限公司);WD-9403C型紫外分析仪(北京市六一仪器厂);HTY反复使用集菌培养器(杭州泰林生物技术设备有限公司);HTY-2000A型集菌仪(杭州高得医疗器械有限公司);YX-400Z智能型全自动不锈钢双层立式电热蒸汽压力消毒器(上海三申医疗器械有限公司)。

1.2 实验菌种 大肠埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44 102］、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)［CMCC(B)26 003］、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63 501］、白念珠菌(Candida albicans)［CMCC(F)98 001］、黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98 003］，由中国药品生物制品检定所提供。

1.3 培养基与试药 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基、改良马丁液体培养基、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸(MUG)培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基均由中国药品生物制品检定所提供。pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，0.9%无菌氯化钠溶液。咽舒饮合剂(武汉市第一医院自制，批号:100318)。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 ①取经35℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物毫升，用0.9%无菌氯化钠溶液配制成每毫升含菌数为50～100 cfu的菌悬液，备用。②取经25℃培养24～48 h的白念珠菌改良马丁液体培养物1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液配制成每毫升含菌数为50～100 cfu的菌悬液，备用。③取经25℃培养1周的黑曲霉改良马丁斜面培养物，加0.9%无菌氯化钠溶液10 mL洗下真菌孢子，吸取菌液用0.9%无菌氯化钠溶液配制成每1 mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液，备用。

2.2 供试液制备 取供试品10 mL加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90mL，摇匀，作为1∶10供试液备用。

2.3 细菌、真菌和酵母菌计数方法的验证

2.3.1 实验组 取1∶10供试液1 mL，注入微生物限度用薄膜过滤器中，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL冲洗(每次100 mL)，最后一次冲洗液中加入阳性菌50～100 cfu，取出滤膜，菌面向上置相应的培养基贴膜培养，置规定的温度培养至规定的时间，逐日观察结果，做菌落计数，测定所加入的试验菌数，并平行制备3个平皿。

2.3.2 菌液组 取试验菌50～100 cfu注入平皿中，立刻倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定的温度培养至规定的时间，逐日观察结果，做菌落计数，测定所加入的试验菌数，并平行制备3个平皿。

2.3.3 供试品 对照组取1∶10供试液1 mL，注入微生物限度用薄膜过滤器中，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL冲洗(每次100 mL)，取出滤膜，菌面向上置相应的培养基贴膜培养，置规定的温度培养至规定的时间，逐日观察结果，测定供试品本底菌数，并平行制备3个平皿。

2.3.4 稀释剂 对照组取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1 mL注入微生物限度用薄膜过滤器中，用少量冲洗液冲洗，并加入阳性菌50～100 cfu，取出滤膜，菌面向上置相应的培养基贴膜培养，置规定的温度培养至规定的时间，逐日观察结果。考查稀释剂对实验有无干扰。

2.3.5 回收率的计算 回收率(%)=(实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%。结果见表1。结果表明，大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白念珠菌和黑曲霉回收率均＞70%［1］，表明咽舒饮合剂对细菌、真菌和酵母菌的生长无抑制作用。pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释剂的稀释剂对照组回收率超过70%，表明稀释剂无抑菌作用，对试验无干扰。可采用该方法对咽舒饮合剂进行细菌、真菌和酵母菌测定。

表1 咽舒饮合剂细菌、真菌和酵母菌回收率的测定cfu·mL-1

2.4 控制菌检查方法的验证

2.4.1 供试液的制备 同“2.2”项下。

2.4.2 实验组 取1∶10供试液10 mL薄膜过滤，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL冲洗(每次100 mL)，取出滤膜加至100 mL胆盐乳糖培养基中，同时加入大肠埃希菌液50～100 cfu，置35℃培养24 h。取上述培养物0.2 mL接种至含MUG培养基5 mL的试管中培养，分别于5，24 h在366 nm波长紫外线下观察荧光，然后进行靛基质实验，观察结果;另取培养物划线接种于曙红亚甲蓝平板，35℃培养18～24 h，观察其菌落形态。

2.4.3 阴性菌对照组 取1∶10供试液10 mL薄膜过滤，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL冲洗(每次100 mL)，取出滤膜加至胆盐乳糖培养基100 mL中，同时加入上述金黄色葡萄球菌 50～100 cfu，置35℃培养24 h。取上述培养物0.2 mL，接种至含MUG培养基5 mL的试管中培养，分别于5，24 h在366 nm波长紫外线下观察荧光，然后进行靛基质实验，观察结果;另取培养物划线接种于曙红亚甲蓝平板，35℃培养18～24 h，观察其菌落形态。结果见表2。结果表明，按该方法检查咽舒饮合剂对大肠埃希菌的生长无抑制作用，可采用该方法对咽舒饮合剂进行大肠埃希菌控制菌的检查。

表2 两组大肠埃希菌检查方法验证结果

3 讨论

由于咽舒饮合剂中含有金银花，金银花水提取物对金黄色葡萄球菌菌、大肠埃希菌、枯草杆菌、青霉菌、黄曲霉、黑曲霉等均有抑菌作用［4-5］，并提示提取温度、时间、抽提比等对结果有影响;对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、甲(乙)型链球菌，尤其是金黄色葡萄球菌的抑菌效果明显［6］;对金黄色葡萄球菌菌、大肠埃希菌、变形链球菌等有良好的抗菌活性［7］;所以采用薄膜过滤法去除制剂本身的抑菌活性。冲洗液的用量以200，300，400，500 mL进行研究验证，最终确定为300 mL，可以消除制剂本身的抑菌活性，菌回收率均达标，且不会由于冲洗液用量过大造成滤膜上微生物受损死亡。

方法验证所用菌株选择的原则［1］:选择代表性、普遍性、低或非致病性的标准菌株。菌种传代次数不超过5代，采用适宜的方法保存，应防止变异。菌液浓度控制50～100 cfu之间。且为保证每次实验菌数一致性，应将制备好的菌液置于4℃冰箱内保存一定时间，另外制备好的菌悬液存放时间不超过6 d时可以连续使用，时间超过1周，其含菌数可能超出范围。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录216-219.

［2］ 张玉兰，洪建文，罗翰宇.复方丹参片微生物检查限度方法的建立［J］.中药材，2005，28(8):728-730.

［3］ 刘炳茹，董利霞，乙静平.五种蒙成药微生物限度检查的方法验证［J］.中国民族医药杂志，2006，5(2):58-59.

［4］ 赵良忠.金银花水溶性抗菌物质的提取及其抑菌效果研究［J］.中国生物制品学杂志，2006，19(2):201-203.

［5］ 程璐，徐宏峰，张耕.高效液相色谱法测定咽舒饮合剂中绿原酸的含量［J］.医药导报，2009，28(1):105-107.

［6］ 宋海英.金银花的体外抑菌作用研究［J］.时珍国医国药，2003，14(5):269.

［7］ 张红锋.中药金银花提取物的体外抑菌作用［J］.华东师范大学学报，2000，1(1):107-108.