程丽娟，陈晓农，刘青川，徐雪钰，苏成虎，于珊，黄正明

(1.北京化工大学材料科学与工程学院，100029;2.解放军第302医院药学部，北京 100039;3.解放军第309医院药剂科，北京 100091)

灵五颗粒(lingwu granules，LW)是由菌草灵芝、五味子等组成，临床用于治疗慢性乙型肝炎，具有扶正活血、疏肝利胆、保肝降酶等功效，主治慢性传染性乙型肝炎引起的肝功能［丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)］异常，早期肝纤维化，肝硬化致腹腔积液，残黄(血清胆红素升高)等症。为了将其研发为使用方便的现代制剂，笔者采用了现代科学技术，将临床应用多年的菌草灵芝、五味子等方药精制成了口服方便的颗粒制剂。由于LW对慢性乙型肝炎治疗有效，在先期LW对D-半乳糖胺致小鼠急性肝实质细胞损伤具有明显的保肝降酶作用［1］的基础上，笔者在本研究选用以四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)诱导大鼠慢性肝损伤(早期纤维化)为模型，进一步对LW防治慢性肝损伤的作用进行实验研究，并对其可能的作用机制进行了初步探讨，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 两批实验Wistar大鼠(SPF级)共90只。实验开始时大鼠体质量150～170 g，雄性。第1批大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号:SCXK(京)2006-0009;第2批购于军事医学科学院五所，动物合格证号:SCXK-(军)2007-004。大鼠饲养于解放军第302医院标准封闭式清洁级(二级)动物房内饲养，由获得资格认可的人员饲养。大鼠在实验过程中自由摄食。

1.1.2 药品、试剂盒 LW颗粒(解放军第302医院自制，批号:20091225)，六味五灵片(山东世博金都药业有限公司，批号:100110)，苯巴比妥片(上海信谊药厂有限公司，批号:091001)，CCl4(分析纯，批号:20080421)，橄榄油(北京古船油脂有限责任公司)。丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、组织蛋白、羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)试剂盒购于南京建成生物工程研究所;ALT、AST、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、清蛋白(albumin，ALB)、总蛋白(total protein，TP)试剂盒购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

1.1.3 仪器 BS-120全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，722型可见光分光光度计(上海元析仪器有限公司)，TGL-16G离心机(飞鸽牌系列离心机，上海安亭科学仪器厂)，85-2型恒温磁力搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)，涡旋混匀器(其林贝尔仪器制造公司)，XMTB-608型水浴锅(余姚市长江温度仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 健康Wistar大鼠90只(两批实验大鼠总和)，购来适应3 d后，随机分为6组，第1批48只，每组8只，第2批42只，每组7只，即正常组，模型组，阳性对照组(给予六味五灵片0.81 g·kg-1);高、中、低剂量药物组(给予 LW 颗粒 7.00，3.50，1.75 g·kg-1)。

1.2.2 诱导肝药酶、造模及给药 正常组自由饮水，其余5组给予350 mg·L-1苯巴比妥水溶液，饮用2周。实验第3周开始，造模并给药。首次致毒剂量为0.08 mL，以后按0.8 mL·(100 g)-1体质量灌胃50%CCl4橄榄油溶液致毒，每周1次，连续5周;正常组灌胃橄榄油作为溶剂对照。自造模之日开始，灌胃给药，qd，连续5周，正常组和模型组灌胃0.9%氯化钠溶液作为空白对照。

1.2.3 取材 末次给药后，大鼠禁食不禁水，16 h后称定质量全部处死，股动脉取血，并迅速取肝脏、脾、胸腺称定质量，从肝左中叶剪一小块组织，用10%甲醛固定，供组织病理学检查;另剪取一块肝组织于冰0.9%氯化钠溶液中漂洗除去血液，滤纸吸干，称取约0.2 g，放入玻璃匀浆管，加冰氯化钠溶液2 mL，用匀浆机10 000～15 000 r·min-1研磨制备10%组织匀浆，用于氧化和抗氧化指标的检测。

1.2.4 血清生化指标的检测 用BS-120全自动生化仪检测血清中ALB、TP含量和AST、ALT、ALP活性。

1.2.5 肝组织生化指标检测 肝组织中Hyp、MDA含量检测及SOD活力检测用相应的试剂盒，具体操作按试剂盒要求。

1.2.6 血清和肝脏中生化指标改变率的计算 生化指标改变率(%)=︱(模型对照组生化指标平均值-给药组生化指标平均值)︱/(模型对照组生化指标平均值)×100%。

1.2.7 脏器指数的计算 脏器指数=脏器质量/体质量×100%。

1.2.8 肝脏组织学观察 将10%甲醛固定好的肝组织送解放军第302医院病理科作组织切片，观察并摄影。

1.2.9 统计学方法 实验结果用均数±标准差(x±s)表达，用单因素多水平的方差分析处理数据，采用SPSS17.0软件实施。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LW对慢性肝损伤大鼠血清中ALT、AST、ALP活性的影响 两批实验血清生化指标检测结果表明，模型组ALT、AST、ALP活性显著高于正常组，差异有统计学意义(P＜0.01)，给予LW药物干预后，酶活性降低。两批实验中，高剂量药物组ALT和ALP降低最为显著(P＜0.01);AST降低第1批显著(P＜0.05)，第2批差异有统计学意义(P＜0.01)。中剂量药物组ALT、AST、ALP活性显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01或P ＜0.05);低剂量药物组 ALT、AST、ALP活性也有显著作用(P＜0.05或P＜0.01)。随着LW给药浓度的增大，对酶活性的抑制效果越明显，呈现一定的量 效关系。见表1。

表1 6组大鼠血清中ALT、AST、ALP活性的检测值Tab．1 The effects on the indexes of hepatic function of the chronic liver injury ratmodel in 6 groups U·L-1±s

表1 6组大鼠血清中ALT、AST、ALP活性的检测值Tab．1 The effects on the indexes of hepatic function of the chronic liver injury ratmodel in 6 groups U·L-1±s

与模型组比较，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05;与正常组比较，*3 P＜0.01Compared with themodel group，*1 P ＜0.01，*2 P ＜0.05;Compared with the normal group，*3 P ＜0.01

组别 剂量/(g·kg-1)ALT第1批(n=8) 第2批(n=7) 改变率/%AST第1批(n=8) 第2批(n=7) 改变率/%ALP第1批(n=8) 第2批(n=7) 改变率/%灵五高剂量组 7.00 31.18± 7.95*1 29.27± 6.02*1 52.8 122.93±16.79*2 95.61±19.11*1 30.0 110.91±15.57*1 217.44± 35.01*1 41.4灵五中剂量组 3.50 38.90± 7.19*1 31.23± 4.34*1 44.8 111.76±10.73*1 104.71±28.23*1 30.8 113.74±19.90*1 188.07± 22.57*1 43.0灵五低剂量组 1.75 40.83± 6.23*1 34.23± 6.10*1 41.1 129.85±10.79 115.76±18.88*1 21.4 116.04±21.41*2 172.00± 9.10*1 44.3阳性对照组 0.81 46.33±12.38 33.31± 3.61*1 37.0 125.15±36.59*2 91.94±16.78*1 30.4 112.98±28.56*2 201.47± 28.81*1 42.1模型组 … 58.37±16.69*3 71.29±18.47*3 0.0 152.98±13.13*3 159.77±38.96*3 0.0 141.35±13.32*3 560.07±148.05*3 0.0正常组 … 30.15± 1.42 27.69± 3.89 … 101.55±10.78 86.61±14.12 … 103.11±14.57 177.94±21.98…

2.2 LW对慢性肝损伤大鼠肝脏中Hyp含量的影响

两批实验检测结果表明，模型组与正常组比较，Hyp含量非常显著性升高(P＜0.01)，与模型组比较，高剂量药物组两批实验Hyp含量均显著降低(P＜0.01)，中、低剂量药物组第1批实验对于降低Hyp含量有非常显著的作用(P＜0.01)，其抑制率呈明显剂量依赖性关系。见表2。

2.3 LW对慢性肝损伤大鼠血清ALB和TP的影响两批实验检测结果表明，模型组与正常组比较，血清中ALB、TP含量均显著降低(P＜0.01)。与模型组比较，第1批实验ALB含量，阳性对照组和高、中剂量药物组均明显升高(P＜0.05)，低剂量药物组差异无统计学意义(P＞0.05);TP含量，阳性对照组和高、中剂量药物组均明显升高(P＜0.05);第2批实验ALB和TP含量，阳性对照组和高剂量药物组均明显升高(P＜0.05)，中、低剂量药物组均差异无统计学意义(P＞0.05)，其抑制率提示有一定的剂量依赖性关系，见表3。

2.4 LW对慢性肝损伤大鼠肝脏氧化和抗氧化指标的影响 两批实验肝内生化检测结果表明，模型组与正常组比较，MDA含量显著升高(P＜0.01或 P＜0.05)，SOD活力降低非常明显(P＜0.01或P＜0.05)。给予LW治疗后，高剂量药物组MDA含量显著降低(P＜0.05)，SOD活力明显升高(P＜0.05)，中、低剂量药物组对于降低MDA含量均有明显作用，对于提高SOD活力没有显著作用，见表4。

表2 6组大鼠肝组织Hyp含量Tab．2 The Hyp content in hepatic tissue of rat in 6 groups ±s

表2 6组大鼠肝组织Hyp含量Tab．2 The Hyp content in hepatic tissue of rat in 6 groups ±s

与模型组比较，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05;与正常组比较，*3 P＜0.01Compared with the model group，*1 P ＜ 0.01，*2 P ＜ 0.05;Compared with the normal group，*3 P ＜0.01

组别 剂量/(g·kg-1)Hyp/(μg·g-1)第1批(n=8) 第2批(n=7)改变率/%灵五高剂量组 7.00 330.34±42.10*1 152.90±14.33*1 45.1灵五中剂量组 3.50 341.17±68.87*1 187.11±26.36*2 34.7灵五低剂量组 1.75 351.73±48.14*1 217.72±23.21*2 28.1阳性对照组 0.81 406.89± 81.85*1 175.31±32.53*1 31.1模型组 … 560.86±111.66*3 268.07±49.82*3 0.0正常组 … 288.02±17.91 117.92±15.37…

表3 6组大鼠血清蛋白比较Tab．3 The comparison of protein content in the serum of rat in 6 groups g·L-1±s

表3 6组大鼠血清蛋白比较Tab．3 The comparison of protein content in the serum of rat in 6 groups g·L-1±s

与模型组比较，*1 P＜0.05;与正常组比较，*2 P＜0.01Compared with themodel group，*1 P ＜0.05;Compared with the normal group，*2 P ＜0.01

组别 剂量/(g·kg-1)ALB第1批(n=8) 第2批(n=7) 改变率/%TB第1批(n=8) 第2批(n=7) 改变率/%灵五高剂量组 7.00 48.18±2.08*1 48.56±2.42*1 1.95 78.03±2.96*1 77.84± 5.18*1 1.80灵五中剂量组 3.50 47.11±1.31*1 45.43±3.61 1.25 78.83±2.18*1 75.94± 7.43 3.05灵五低剂量组 1.75 45.33±3.70 45.97±0.92 -0.15 78.85±5.60 73.89± 2.05 1.70阳性对照组 0.81 49.95±2.28*1 47.34±2.69*1 6.40 78.91±3.65*1 76.31± 5.26*1 2.00模型组 … 45.61±1.50*2 45.81±2.28*2 0.00 75.34±2.41*2 74.83± 3.40*2 0.00正常组 … 50.34±2.36 52.93±5.68 … 85.50±6.99 87.96±12.17…

2.5 LW对慢性肝损伤大鼠脏器指数的影响 实验结果表明，与正常组比较，两批实验的模型组大鼠肝、脾指数显著升高(P＜0.01)，胸腺指数第1批降低不明显(P＞0.05)，第2批降低明显(P＜0.01)。给予LW治疗后，第1批大鼠的肝指数有降低趋势，差异无统计学意义(P＞0.05)，高剂量药物组脾指数治疗后明显降低(P＜0.05)，中、低剂量药物组有降低趋势，差异无统计学意义(P＞0.05)，胸腺指数有升高趋势，差异无统计学意义(P＞0.05);第2批大鼠的肝指数显著降低(P＜0.01)，脾指数有升高趋势，差异无统计学意义(P＞0.05)，高、中剂量药物组可显著升高胸腺指数(P＜0.01)，低剂量药物组明显升高胸腺指数(P＜0.05)。以对脏器肿大(肝脾)和缩小(胸腺)的抑制率和增大率计算，低、中、高剂量药物组与阳性对照组均显示较好的效果，尤其高剂量药物组效果最明显，呈现一定的剂量依赖性，见表5。

2.6 LW对CCl4致大鼠慢性肝损伤保护作用的病理观察结果 光镜下，正常动物组肝组织清晰，肝小叶结构完整，肝细胞呈放射状排列，肝汇管区清楚;模型组肝组织模糊不清，肝小叶结构完全破坏，大量的肝细胞脂肪变性，肝组织见明显的纤维增生，汇管区大量的炎细胞浸润;阳性对照组肝组织较清晰，肝小叶轮廓尚存，但结构不清，大量的肝细胞脂肪变性，多见于大泡状，并可见局灶性坏死，肝组织未见明显的纤维增生，汇管区炎细胞浸润;高剂量药物组肝组织清晰，肝小叶结构完整，肝细胞有片状脂肪性变，肝组织未见明显的纤维增生，肝汇管区清楚;中剂量药物组肝组织较清晰，肝小叶结构不完整，肝细胞脂肪性变，肝组织未见明显的纤维增生，肝汇管区可见炎细胞浸润;低剂量药物组肝组织模糊不清，肝小叶轮廓不清，大量肝细胞呈脂肪性变，肝组织可见纤维增生，肝汇管区有大量炎细胞浸润。

3 讨论

CCl4诱导制备慢性肝损伤动物模型是一种经典的造模方法，其造模途径多样，病理特征稳定，已广泛用于研究慢性肝损伤、肝纤维化发生的细胞及分子机制、血清学标志物与组织病理的相关性及抗慢性肝损伤的药效评价［2］。故本实验采用50%CCl4橄榄油溶液灌胃制备慢性肝损伤以观察LW的药效及其可能机制。

大鼠通过连续5周的50%CCl4橄榄油溶液灌胃中毒，经肝组织病理学镜检观察证实，不仅造成慢性肝实质细胞损伤，而且肝组织间已有早期肝纤维化的形成，基本符合临床慢性乙型肝炎的病理变化特征。慢性肝损伤的早期肝纤维化的形成因素有多种，主要是肝细胞外成分胶原蛋白等异常增生而降解不足的结果，也是多种慢性肝病发展为肝硬化必经的病理过程。Hyp既是胶原蛋白形成的主要成分，也是判断慢性肝损伤及其早期肝纤维化的重要指标。从本实验的生化检测和病理观察结果分析，由于CCl4模型组动物肝内Hyp的含量明显增多，因而肝组织间胶原蛋白量增多，所以促使了早期肝纤维化的形成。当给予LW干预后，高、中、低3个剂量组动物肝内Hyp的含量均明显低于CCl4模型组，并有明显的剂量依赖性，表明LW对CCl4所致动物慢性肝损伤及其早期肝纤维化具有较好的防治作用。

表4 6组大鼠肝脏氧化和抗氧化指标的比较Tab．4 The comparison of oxidation and antioxidant function of the rat in 6 groups ±s

表4 6组大鼠肝脏氧化和抗氧化指标的比较Tab．4 The comparison of oxidation and antioxidant function of the rat in 6 groups ±s

与模型组比较，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01;与正常组比较，*3 P ＜0.05，*4 P＜0.01Compared with themodel group，*1 P ＜0.01，*2 P ＜0.05;Compared with the normal group，*3 P ＜0.05，*4 P ＜0.01

组别 剂量/(g·kg-1)MDA/(nmol·mg-1)第1批(n=8)第2批(n=7)改变率/%SOD/(U·mg-1)第1批(n=8)第2批(n=7)改变率/%灵五高剂量组 7.00 1.26±0.36*1 0.99±0.12*2 30.9 552.89±80.30*1 136.28±11.78*1 19.3灵五中剂量组 3.50 1.42±0.33 1.02±0.12*2 25.7 524.52±71.05 134.34±7.25*1 15.3灵五低剂量组 1.75 1.52±0.39 1.08±0.05*2 20.7 484.51±58.56 126.68±6.61 7.6阳性对照组 0.81 1.69±0.59 1.07±0.15*2 16.8 550.89±48.08*1 134.63±8.58*1 18.3模型组 … 2.03±0.77*3 1.29±0.17*4 0.0 461.34±59.56*3 114.94±18.98*4 0.0正常组 … 1.37±0.31 0.97±0.03 … 552.69±67.63 153.06±21.16…

表5 6组大鼠肝脾肿大、胸腺萎缩比较Tab．5 The comparison of hepatosplenomegaly and thym ic atrophy of the rat in 6 groups %，±s

表5 6组大鼠肝脾肿大、胸腺萎缩比较Tab．5 The comparison of hepatosplenomegaly and thym ic atrophy of the rat in 6 groups %，±s

与模型组比较，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05;与正常组比较，*3 P＜0.01Compared with themodel group，*1 P ＜0.01，*2 P ＜0.05;compared with the normal group，*3 P ＜0.01

组别 剂量/(g·kg-1)肝指数第1批(n=8) 第2批(n=7) 改变率脾指数第1批(n=8) 第2批(n=7) 改变率胸腺指数第1批(n=8) 第2批(n=7) 改变率灵五高剂量组 7.00 2.99±0.16 3.58±0.11*1 11.0 0.24±0.02*2 0.25±0.01 10.4 0.15±0.02 0.13±0.01*1 25.1灵五中剂量组 3.50 3.02±0.28 3.63±0.14*1 9.9 0.25±0.02 0.26±0.01 8.3 0.14±0.01 0.13±0.01*1 18.8灵五低剂量组 1.75 3.06±0.16 3.65±0.15*1 9.0 0.27±0.04 0.26±0.02 3.8 0.13±0.01 0.12±0.01*2 13.2阳性对照组 0.81 3.02±0.11 3.62±0.44*1 10.1 0.26±0.01 0.26±0.01 4.2 0.15±0.03 0.12±0.01*2 20.0模型组 … 3.07±0.20*3 4.44±0.27*3 0.0 0.28±0.03*3 0.27±0.06*3 0.0 0.13±0.01 0.10±0.01*3 0.0正常组 … 2.57±0.13 2.98±0.05 … 0.21±0.01 0.21±0.01 … 0.16±0.03 0.13±0.02…

CCl4所致大鼠慢性肝损伤重要指标是血清ALT、AST、ALP酶活性的明显升高，ALB、TP含量的明显降低和肝病理学的变化［3-4］。本实验CCl4模型组大鼠血清ALT、AST、ALP酶活性均显著升高，ALB、TP含量明显降低，肝组织病理明显改变和肝脾指数升高，胸腺指数降低，表明造模成功。经给予LW干预后，高、中、低3个剂量组动物血清中ALT、AST、ALP酶活性均显著降低，ALB、TP含量明显升高，肝组织病理明显改善，肝脾指数降低，胸腺指数增加，表明LW对CCl4所致动物慢性肝损伤具有明显的保肝降酶作用。

当CCl4进入肝脏，激活肝脏细胞色素P450，继而生成CCl3，即三氯甲基自由基，攻击肝细胞内质网膜上的磷脂分子，引起膜的脂质过氧化，引起膜结构和功能完整性的破坏［5-6］。随着中毒次数与时间的增加和延长，慢性肝损伤及其早期肝纤维化就会越来越明显。SOD是机体防御氧自由基损伤和破坏的一种重要金属酶［7-8］，可使自由基发生歧化反应，阻止 CCl4分解为CCl3自由基团，保护细胞免受损伤。本研究结果显示，LW可显著增加受损机体SOD活力，从而增强机体抗氧化能力，加速自由基的清除，抑制脂质过氧化反应，抑制过氧化产物MDA产生及清除过量的MDA，从而保护肝脏的结构和功能。

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