彭英，霍仕霞，康雨彤，闫明

(1.石河子大学药学院，832000;2.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，乌鲁木齐 830049)

白癜风是一种常见的皮肤疾病，其发病机制尚不清楚，存在自身免疫学说、黑素细胞自毁学说等假说。其中黑素细胞学说中的黑素减少是本病的表观显示指标，可能与本病的发生有直接联系，黑素细胞的生成过程又与酪氨酸酶直接相关。笔者在本实验以维吾尔医治疗白癜风的传统复方驱白巴布期胶囊为研究对象，通过动物实验考察其对实验性白癜风的作用，对其疗效做初步判断，为进一步进行驱白巴布期胶囊的作用机制探讨做铺垫。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试药物 驱白巴布期胶囊由补骨脂、驱虫斑鸠菊、高良姜、白花丹、盒果藤等5味药材制成，由新疆华康药业提供，批号:100140。常温下保存，配制方法:溶解在5%羧甲基纤维素钠水溶液中(剂量依据:人临床剂量换算成豚鼠剂量，单位:mg·kg-1·d-1)。

1.1.2 仪器 生物组织摊烤片机(KZPG-1A)，生物组织包埋机(BMG-1)，切片机(RM2235)，光学显微镜(LEICA DM2500)，恒温水浴箱(上海亚荣生物仪器厂)。

1.1.3 实验动物 黑色豚鼠112只，体质量(250±20)g，雌雄各半，由南方医科大学实验动物中心提供。

1.1.4 主要试剂 白灵片(佛山冯了性药业有限公司生产，批号:100702)，氢醌(天津市天新精细化工开发中心，批号:20100120)，Dopa-氧化酶(Sigma公司)，鼠抗人酪氨酸酶单克隆抗体(Sigma公司)，DAB-H2O2(Sigma公司)，Elvision试剂(Sigma公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 黑色豚鼠112只，随机分为正常对照组、模型组、阳性药物对照组(给予白灵片1 128 mg·kg-1·d-1)，低、中、高剂量给药组(分别给予驱白巴布期胶囊 580，1 160，2 320 mg·kg-1·d-1)，自身恢复组，中剂量预防组(给予驱白巴布期胶囊1 160 mg·kg-1·d-1)，每组雌雄各7只。

1.2.2 白癜风动物模型的建立 参考文献［1］。脱去各组豚鼠背部黑色毛5 cm×5 cm，除正常对照组外，其他7组采用5%氢醌对黑色豚鼠进行皮肤脱色，正常对照组豚鼠每天涂抹等量0.9%氯化钠溶液。连续涂抹30 d。在此期间，豚鼠每3 d在受试区脱毛1次。

1.2.3 给药方法 正常对照组、模型组、自身恢复组不做任何处理，中剂量预防组从造模开始时给药，连续给药观察60 d。其余各组造模30 d后开始给药，连续观察给药30 d。

1.2.4 指标检测 治疗结束后，肉眼观察各组药物治疗豚鼠实验性白癜风的效果。于受试区中心取皮肤1 cm×1 cm，固定，石蜡包埋，切片后观察黑素细胞，进行Dopa-氧化酶染色和Lillie染色观察豚鼠表皮黑素细胞(melanocytes，MC)、含黑素颗粒基底细胞、酪氨酸酶含量变化。

1.3 酷氨酸酶强度判定标准 参考文献［2］。酪氨酸酶阳性产物定位于细胞质内，显镜下细胞内出现黄色或棕黄色颗粒、或团块状为阳性表达。采用二级计分法判定结果，阳性细胞计＜5%为0分;～25%为1分;～50%为2分;～75%为3分;＞75%为4分。按染色强度分类:淡黄色1分;黄或深黄2分;褐或棕黄色3分。两者相加＜2分为阴性(-)，2～3分为阳性(+)，4～5分为中等阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。

1.4 统计学方法 用SPSS软件对实验结果进行t检验统计学处理。组间计数资料比较均采用Wilcoxon秩和检验。P＜0.05表示差异有统计意义。

2 结果

2.1 驱白巴布期胶囊对皮肤黑色素的影响 肉眼观察可见，用5%氢醌后，各氢醌脱色组动物受试区皮肤较正常对照组动物受试区皮肤明显偏白。其中模型组皮肤颜色最淡，呈苍白色，有白斑，黑毛变成黄毛，有的甚至长出白毛。中剂量预防组动物皮肤较其他氢醌脱色组动物受试区皮肤偏黑。自身恢复组动物皮肤，较其他氢醌脱色组动物受试区皮肤偏白。高、中、低剂量给药组、阳性对照组受试区皮肤肉眼观察无明显差别。

2.2 MC的观察 Dopa-氧化酶染色后，棕黑色染色为黑素细胞阳性。分别于光镜下测定每个高倍镜视野内各组MC数量，每个标本观察10个高倍镜视野，计算每100个表皮基底细胞中MC的平均数量。见表1，图1。

2.3 含黑素颗粒的基底细胞计数 Lillie染色后，黑色素呈暗绿色为阳性，分别于光镜下测定各组含黑素颗粒的基底细胞数量，每个标本观察10个高倍镜视野，计算每100个表皮基底细胞中含黑素颗粒的基底细胞的平均数量。见表1，图2。

表1 8组豚鼠表皮MC计数和含黑素颗粒基底细胞计数Fig．1 The count of epiderm alm elanocytes and basal cell containingmelanin granules of guinea pig in 8 groups%± s，n=14

表1 8组豚鼠表皮MC计数和含黑素颗粒基底细胞计数Fig．1 The count of epiderm alm elanocytes and basal cell containingmelanin granules of guinea pig in 8 groups%± s，n=14

与模型组比较，*1 P＜0.01;与中剂量给药组比较，*2 P＜0.05;与正常对照组比较，*3 P＜0.05，*4 P＜0.01Compared with themodel group，*1 P＜0.01;Compared with themedium dose group，*2 P＜0.05;Compared with the normal control group，*3 P ＜0.05，*4 P ＜0.01

组别 给药剂量/(mg·kg-1·d-1) 表皮MC 含黑素颗粒基底细胞驱白巴布期胶囊低剂量给药组 580 26.1±3.2*1 24.7±2.1*1中剂量给药组 1 160 27.0±2.6*1 28.5±5.0*1高剂量给药组 2 320 33.8±4.3*1 37.1±2.2*1中剂量预防组 1 160 31.1±5.9*1*2 28.9±2.0*1阳性对照组 1 128 36.2±2.3*1 29.5±5.0*1自身恢复组 … 18.5±2.5 23.9±2.7*1模型组 … 14.6±2.2*3 21.0±1.0*4正常对照组 …42.2±2.5 43.1±3.2

2.4 酪氨酸酶含量观察 见图3，表2。

3 讨论

白癜风是一种常见的色素障碍性皮肤病，临床主要表现为黑色素减少或脱失。根据黑色素易受强氧化剂氢醌破坏的特点，参照文献制备白癜风动物模型的方法［1］，选用性质更为稳定的5%氢醌将豚鼠黑色皮肤脱色，连续30 d后，肉眼可见豚鼠皮肤呈苍白色，有白斑，黑毛变成黄毛，有的甚至长出白毛。镜下可见皮肤切片，棘层和毛囊内黑色素减少，有的毛囊内上、中部黑色素完全脱失，而下部有少量黑素细胞，证明本实验模型成功。

在成功制备了白癜风动物模型的基础上，设置了自身恢复组、阳性对照组、中剂量预防组以及高、中、低剂量给药组，通过连续30 d的治疗，自身恢复组动物皮肤，较其他氢醌脱色组动物受试区皮肤偏白。高、中、低给药剂量组、阳性对照药物组受试区皮肤肉眼观察无明显差别。在组织学检查中，给药组表皮黑素分布及含黑素毛囊数明显多于模型组(P＜0.01)，通过免疫组化结果，可发现，酪氨酸酶含量也明显高于模型组(P＜0.01)，表明驱白巴布期胶囊在治疗实验性白癜风上的确是有效的。

在黑素细胞的黑素生物合成过程中，酪氨酸酶是黑素合成的关键酶，其活性决定着黑素合成的速度和产量。酪氨酸酶的表达定位于表皮基底部黑素细胞的细胞质，为黄或棕黄色颗粒，呈局灶性或弥漫性分布。本试验显示与模型组动物受试区皮肤相比，高、中、低剂量给药组酪氨酸酶表达量明显增加，预防给药组动物皮肤受试区酪氨酸酶的表达含量同样高出模型组，说明驱白巴布期胶囊对酪氨酸酶的表达有促进作用，驱白巴布期胶囊可能是通过对酪氨酸酶表达的上调作用治疗白癜风。

图3 8组酪氨酸酶强度光镜图(×400)A.模型组;B.自身恢复组;C.正常对照组;D.中剂量预防组;E.高剂量给药组;F.中剂量给药组;G.低剂量给药组;H.阳性对照组Fig．3 The strength of tyrosinase under lightm icroscope(×400)A.Model group;B.Self-recovery group;C.Normal control group;D.Medium dose prevention group;E.High dose treated group;F.Medium dose treated group;G.Low dose treated group;H.Positive control group

表2 8组豚鼠酪氨酸酶强度结果Tab．2 The strength tyrosinase of guinea pig in 8 groups

驱白巴布期胶囊中所含的主药为补骨脂和驱虫斑鸠菊，补骨脂有致光敏作用，内服或者局部使用，使皮肤对紫外线照射敏感，容易出现色素沉着。补骨脂素和异补骨脂素促使皮肤黑色素的合成，并使之沉积于皮下，临床上利用此作用来治疗白癜风。现代药理学研究表明，驱虫斑鸠菊治疗白癜风的作用机制是多方面的，可通过多途径、多靶点发挥作用［3］。本实验研究为临床治疗白癜风提供了一定的理论根据。

［1］ 张兰兰，闫明，刘晓东，等.两种化学脱色剂对两种动物模拟白癜风作用比较［J］.医药导报，2009，28(6):690-692.

［2］ 薛春雨，邢新，李蠡，等.酪氨酸酶在自体中厚移植皮片中的表达［J］.医学研究生学报，2005，18(5):388.

［3］ 刘铜华，维药驱虫斑鸠菊治疗白癜风的研究与应用［J］.国外医学:中医中药分册，2004，26(2):103.