张 术，陈雅琳，栾 洁，卞晓岚，汪家春

(1.海军医学研究所，上海 200433；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院，上海 200020；3.上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海 200025)

不同来源石斛对SH-SY5Y细胞缺血性损伤保护作用的比较

张 术1，陈雅琳1，栾 洁1，卞晓岚2，3，汪家春1

(1.海军医学研究所，上海 200433；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院，上海 200020；3.上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海 200025)

目的研究市售种植铁皮枫斗和组培铁皮石斛对谷氨酸损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用。方法利用血清药理学方法制备含药血清，用SH-SY5Y细胞建立谷氨酸损伤模型，观察72 h损伤细胞增殖情况，MTT实验测定细胞活性，乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的测定研究两种来源石斛对神经细胞损伤保护作用。结果种植和组培石斛均可提高SH-SY5Y细胞谷氨酸损伤的存活率，降低培养液中LDH含量和细胞内MDA含量，提高SOD活力，其中铁皮石斛胚芽的抗氧化能力优于市售铁皮枫斗。结论石斛具有对SH-SY5Y细胞谷氨酸损伤的保护作用；组培铁皮石斛较市售铁皮枫斗保护作用更加显著，初步证明经过组培繁殖的铁皮石斛作用效果优于市售石斛属药用植物。

铁皮石斛;血清药理学 SH-SY5Y细胞;谷氨酸;细胞损伤

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)，又称黑节草，具有“千金草”之称。《神农本草经》记载石斛“久服厚肠胃, 轻身,延年,长肌肉,逐皮肤邪热,痹气,定志除惊,……”，现代研究也表明，石斛具有抗衰老、抗氧化等功效[1]。具有药用价值的石斛在我国有近四十种，野生资源已经非常稀少，早在1987年就被国家列为野生药材重点二级保护濒危植物。课题组采集的野生安徽霍山石斛，取成年茎作为外植体，进行诱导培养，得到具有很好的遗传稳定性的铁皮石斛胚状体(胚芽)。为评价组培石斛与市售石斛药效，本研究利用血清药理学的方法研究不同来源石斛在人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y谷氨酸损伤方面的保护作用，探讨其对神经细胞缺血性损伤的保护作用，比较两种来源石斛作用药效。

1 材料和方法

1.1仪器 CO2培养箱(Forma Scientific Model3336)；倒置荧光显微镜(OLYMPUS LX70)；激光共聚焦扫描显微镜，Leica TCS SP-2；酶标仪,美国BIO Tek 公司。

1.2材料 SD大鼠24只，雌雄各半，体重180～220 g，由复旦大学实验动物科学部提供。市售石斛(铁皮枫斗)，产地云南，经第二军医大学药学院生药教研室黄宝康教授鉴定为兰科植物金钗石斛(Dendrobiumnobile.Lindl.)；铁皮石斛胚芽由上海汤振生物技术有限公司提供。

DMEM 培养基、新生小牛血清和胰酶均为美国Gibco公司，谷氨酸(Glutamate，Glu)、MTT为美国 Sigma 公司， SOD检测试剂盒、LDH检测试剂盒和MDA检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，其它试剂均为国产分析纯。

1.3实验方法

1.3.1动物分组及含药血清的制备 动物随机分为3组，每组8只,雌雄各半。分为阴性对照组、市售铁皮枫斗组、铁皮石斛胚芽组。铁皮枫斗用蒸馏水提取并浓缩至0.2 g/ml。根据成人用药剂量和大鼠折算系数比公式折算[2]，各组灌胃剂量为6 g/kg，对照组给予等量生理盐水。给药3天，每天2次，于末次给药后1 h ,将大鼠麻醉,腹主动脉取血分离血清, - 70 ℃冰箱保存。

1.3.2细胞模型制备 对数生长期SH-SY5Y细胞按1×105个/ml 接种于96孔培养板中。加入终浓度为 1、5、10、20、40、80、100 mM Glu的培养基与细胞共培养24 h后计算细胞存活率，同时细胞吖啶橙(AO)染色比较正常细胞形态和模型细胞形态，确认谷氨酸损伤细胞模型的最佳浓度。

1.3.3细胞增殖观察 分别将两种含药血清加入到模型细胞培养基中，血清浓度10%，CO2培养箱中培养72 h，AO染色比较空白对照组、模型组和给药组的细胞形态。

1.3.4MTT 法测定细胞活力 参照文献[3]方法进行，对数生长期细胞按1×105个/ml 接种于96 孔培养板中。细胞分成空白组、阴性血清对照组，市售铁皮枫斗和铁皮石斛胚芽组。酶标仪测定吸光度A值。

1.3.5乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定 按1.3.4方法，收集培养液进行LDH活性的检测。检测方法依据试剂盒的说明进行。酶标仪测定OD值，波长490 nm。

1.3.6丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的测定 细胞经含药血清处理后培养4 h，去除原培养液，D-Hank′s液洗2次，加入0.1 mol/L PBS-0.05 mmol/L EDTA (pH8.0)和1% Triton X-100溶解细胞，加入25% H3PO4沉淀蛋白，6 000 r/min离心30 min，取上清液，按试剂盒说明测定。

2 结果

2.1细胞模型制备与细胞增殖观察 终浓度分别为 1、5、10、20、40、80、100 mM Glu的培养基与细胞共培养24 h后测定细胞存活率，细胞染色后可见：正常对照组细胞形态完整呈多边形，突起完好，核为均匀淡蓝色荧光，胞浆为淡红色荧光，视野中可见少量自然凋亡细胞(图1a)；随着Glu浓度增大，细胞死亡脱落量增大，浓度为80 mM时，细胞减少约50%，同时可见很多凋亡或坏死细胞，胞浆呈强红色荧光，形态不规则，胞核浓缩，呈强白色荧光(图1b)。因此本实验采用80 mM Glu处理细胞模型。

加入含药血清的模型细胞，孵育72 h，染色观察细胞可见给药组细胞形态接近完整，呈多边形。视野可见少量凋亡细胞，核皱缩呈强荧光，胞体缩小(图1c，d)。

abcd

图1激光共聚焦显微镜观察SH-SY5Y细胞给药72h增殖情况(×200)

a-空白对照组；b-80 mM Glu模型组；c-市售铁皮枫斗组；d-铁皮石斛胚芽组

2.2MTT实验 以80 mM Glu作为SH-SY5Y细胞损伤模型， 应用含不同来源石斛的血清作用于SH-SY5Y细胞24 h，发现含药血清对Glu损伤细胞有显著的保护作用(P<0.05，如表1)。

表1 不同浓度药物血清对SH-SY5Y细胞的保护作用

1)P<0.01,与80 mM Glu处理组比较

2.3LDH活性测定 Glu损伤的细胞培养液内LDH释放明显增加(P<0.01)。含药血清加入培养液中可明显降低损伤细胞LDH的释放，与模型组相比，均有显著性差异(P<0.01)，其中含铁皮石斛胚芽血清组LDH水平低于含市售铁皮枫斗血清组 (P<0.05)；空白血清组与模型组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表2。

表2 含石斛血清对Glu损伤的SH-SY5Y细胞LDH释放的影响

1)P<0.01与正常对照组比较；2)P<0.01与模型组比较；3)P<0.05与铁皮枫斗组比较

2.4MDA、SOD检测结果 ROS在Glu导致的神经元损伤中起着重要作用，而SOD在细胞清除氧自由基的机制中发挥着重要作用。笔者研究发现80 mM Glu处理细胞后培养基中SOD酶的含量与对照组比较显著降低；含药血清与模型组比较，SOD显著升高(P<0.01)，含铁皮石斛胚芽组SOD含量高于市售石斛组 (P<0.05)；空白血清组与模型组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。同时，含铁皮枫斗和组培石斛血清能明显减少MDA的生成，与模型组比较差异显著(P<0.01)，含铁皮石斛胚芽组MDA含量低于铁皮枫斗组 (P<0.05)。结果见表3。

表3 含石斛血清对Glu损伤的SH-SY5Y细胞MDA、SOD释放的影响

1)P<0.01，与正常对照组比较；2)P<0.01，与模型组比较；3)P<0.05与铁皮枫斗组比较

3 讨论

现代药理学认为，石斛属植物具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老等功效。家兔实验表明，石斛能显著提高超氧化歧化酶(SOD)水平,从而起到降低乳过氧物酶(LPO)的作用[5]。其中石斛的重要有效成分石斛多糖及酚类化合物均具有抗氧化作用。自由基水平的升高作用于机体引起组织和细胞的损伤，是许多疾病发生发展的重要因素。SOD能够清除氧阴离子自由基，保护细胞，间接反映了机体清除氧自由基的能力[6,7]；MDA是氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸形成脂质过氧化物的一种，其量的变化常常反映体内脂质过氧化物的程度，间接反映细胞损伤的程度[8,9]。自由基连锁反应是脑缺血损伤，尤其是迟发性神经元损伤的主要原因[10]。笔者研究发现Glu引起的细胞过氧化反应可以被含石斛血清显著抑制，同时含石斛血清可以显著提高细胞SOD酶的含量，从而加速ROS的清除。这一结果提示石斛具有对神经细胞缺血性损伤的保护作用。

本研究选用的组织培养铁皮石斛与市售铁皮枫斗药效学评价显示，铁皮石斛胚芽清除氧自由基、降低损伤神经细胞LDH的释放能力，以及对Glu损伤细胞的保护作强于市售石斛，表明组织培养铁皮石斛优于人工种植石斛来源的药效，初步证明经过组织培养快速繁殖可解决其资源紧缺问题的有效途径。

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2011-03-16

[修回日期]2011-04-22

ProtectiveeffectofdifferentsourceofDendrobiiCaulisonischemicinjuryinSH-SY5Ycells

ZHANG Shu1，CHEN Ya-lin1，LUAN Jie1，BIAN Xiao-lan2,3, WANG Jia-chun1

(1. Naval Medical Research Institute of CPLA, Shanghai 200433, China；2. Luwan Branch of Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200020,China; 3. Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025,China)

ObjectiveTo study the protective effects of plantingDendrobiicaulisand tissue culture plantingDendrobiumofficinaleKimuraetMigoon glutamate damage induced in cultured SH-SY5Y cells.MethodsThe sera were obtained from rats by using the serum pharmacology method, and cell damage model was established by treating SH-SY5Y cells with glutamate. the proliferation of damaged cells were observed by 72 h. MTT assay was used to test lactate dehydrogenase(LDH), malondialde-1yde(MDA)and superoxide dismutase (SOD) in the culture medium.ResultsBoth planting and tissue cultureDendrobiicauliscould promote the cell proliferation of glutamate damaged SH-SY5Y cells. They also could decrease LDH and MDA content and increase SOD level significantly. Tissue culturedDendrobiicaulispreceded planting ones in antioxidant potential.ConclusionDendrobiicaulishad protective effect on glutamate damaged SH-SY5Y cells. The protective effect of tissue culture one, while, was more distinctive than planting one, which could prove that officinal effect of tissue cultureDendrobiumhuoshanensewas preceded toDendrobiumplants.

DendrobiumofficinaleKimuraetMigo, serum pharmacology method, SH-SY5Y cells, glutamate, cell damage

张 术(1978-)，女，硕士，助理研究员.Tel:(021)81883189,E-mail:zh_shu@hotmail.com.

卞晓岚.E-mail:bxl40338@rjh.com.cn.

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1006-0111(2011)06-0439-03