纪松岗，吴海棠，苗华艳，吴 思，李 祥

(1.解放军第401医院药剂科,山东 青岛 266071;2.第二军医大学药学院，上海 200433；3.解放军62370部队,北京 100071；4.解放军62380部队，北京 100071)

中药复方二神丸主要化学成分的高效液相-飞行时间质谱分析

纪松岗1，吴海棠2，苗华艳3，吴 思2，李 祥4

(1.解放军第401医院药剂科,山东 青岛 266071;2.第二军医大学药学院，上海 200433；3.解放军62370部队,北京 100071；4.解放军62380部队，北京 100071)

目的通过高效液相-飞行时间质谱(HPLC-TOF/MS)联用技术,对中药复方二神丸中的主要化学成分进行有效的鉴定。方法色谱分离采用资生堂 Capcell Pak C18反相柱(3.0 mm×100 mm, 3 μm)，流动相组成分别为0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脱，流速为0.6 ml/min；质谱定性采用飞行时间质谱，正离子模式扫描。结果在优化的液质联用条件下，通过飞行时间质谱鉴定出二神丸中21个成分，其中15种成分来自补骨脂,6种成分来自肉豆蔻。结论通过RRLC-TOF/MS联用技术，为鉴定二神丸中的化学成分建立起了一种快速、高效的分析方法。

二神丸；高效液相-飞行时间质谱；化学成分

二神丸出自宋·许叔微的《普济本事方》,由补骨脂和肉豆蔻组成，为临床常用方剂,功可温肾暖脾,涩肠止泻[1]。明代薛己《内科摘要》对二神丸也有所记载，并将二神丸与五味子散两方合为四神丸，为治疗肾泄的名方[2]。李冀等[3, 4]以二神丸、四神丸对脾虚泄泻治疗作用进行了系统研究，唐昌娟等[2]以四神丸除去五味子散后的药物组方配比加水煎煮后得到二神汤，并对其进行大鼠体内药动学研究。但目前尚未见到有关二神丸主要化学成分分析的报道。而中药复方中多成分的鉴定分析是中药现代化研究的重要组成部分之一，对阐明中药复方药效物质基础、质量控制、开发现代中药新药等具有重要意义。传统分析方法通常需要经过复杂的分离和提取过程而得到单一化学成分,继而通过核磁共振(NMR)、质谱(MS)等其它分析技术进行鉴定。但这种方法费时费力，并且只对某一类化合物鉴定，难以完整、系统地体现中药复方中多类成分的复杂性[5]。而高分辨率飞行时间质谱作为新起且发展迅速的质谱技术，具有检测灵敏度高，测定化合物质荷比精确，离子扫描范围宽等优点，可与液相色谱联用，现已越来越多的用于中药分析中[6, 7]。

本研究采用HPLC-TOF/MS技术对二神丸中多成分进行鉴别，该法操作简便、快速、准确，为二神丸的药效物质基础研究及质量控制提供重要依据。

1 仪器和试药

安捷伦1200型液相色谱仪，包括在线脱气机，二元泵，高性能自动进样器；安捷伦G6220A飞行时间质谱仪，配有标准电喷雾离子源(ESI)，MassHunter色谱工作站和Qualitative Analysis质谱分析软件；R201型旋转蒸发器(上海申胜生物技术有限公司)。

补骨脂、肉豆蔻药材购自上海雷允上北区中达大药房，补骨脂素和异补骨脂素标准品购自中国生物制品检定所。

HPLC级乙腈(Merck，Germany)；HPLC级甲酸(Tedia，USA)；无水乙醇为分析醇(中国医药集团上海化学试剂公司)；水为娃哈哈纯净水。

2 试验

2.1色谱及质谱条件

2.1.1色谱条件 色谱柱：Capcell Pak C18(3.0 mm×100 mm, 3 μm)，流动相：0.1%甲酸水溶液A，乙腈B；梯度洗脱：0～10 min(0%B～25%B)，10～45 min(25%B～75%B), 45～50 min(75%B)；柱温30 ℃，进样体积5 μl，流速0.6 ml/min。

2.1.2质谱条件 电喷雾正离子模式；质量扫描范围m/z 110～1 000；毛细管电压4 000 V; 雾化气压力40 psi；干燥气流速10 L/min；干燥气温度350 ℃；碎片电压160 V。选择参比校准液做实时质量数校正。实验数据采用Qualitative Analysis软件处理。测定样品之前，使用调谐液校准质量轴，以保证质量精度误差小于2 ppm。

2.2供试品溶液制备 按二神丸处方比例称取补骨脂1.0 g、肉豆蔻0.5 g，加入80%乙醇30 ml，超声30 min，取5 ml醇提液，10 800 r/min离心5 min，取上清在“2.1”项下色谱条件下进样分析。

2.3二神丸中化学成分数据库的建立 根据二神丸各组方药材的化学成分研究报道，收集了补骨脂化学成分68个，肉豆蔻化学成分49个，并通过安捷伦“formula-database-generator”软件建立二神丸各组方药材中已知化学成分的数据库。

3 结果与讨论

3.1实验条件优化 首先考察了甲醇-水和乙腈-水2种体系，结果显示乙腈的洗脱效果要优于甲醇，故选择乙腈作为有机相。在流动相体系中加入甲酸可增加质谱响应，实验考察了甲酸的添加量对分离的影响，结果发现甲酸浓度在0.1%时大多数成分有不错的质谱响应。因此，最终采用0.1%甲酸水溶液作为水相。

质谱检测分别比较了正、负离子2种扫描模式，结果发现正模式下峰容量更大、质谱响应更强，故实验最终选择在正模式下进行。

3.2二神丸中主要化学成分的鉴别 在优化的色谱质谱条件下，二神丸提取液的HPLC-TOF/MS典型总离子流图见图1。笔者对其中主要的21个峰进行了鉴别，其中包括4对同分异构体。其中，峰1和2这一对同分异构体，两者质谱裂解所得碎片离子相同，故通过对比标准物质的保留时间和质谱图，判定峰1为补骨脂素，峰2为异补骨脂素。其它化合物按照以下方法鉴别：首先，根据TOF/MS上所得到的精确化合物分子量信息，通过MassHunter软件在5 ppm的质量偏差范围内计算其可能的元素组成，并将其与所建的数据库相匹配，对二神丸化学成分的初步鉴别，结果见表1。然后对同分异构体进行鉴别，调节碎片电压至360 V，获得化合物结构相关的碎片离子，根据离子的裂解情况，结合数据库中各化合物的化学结构，区分各同分异构体，结果见表2。

图1 二神丸提取物TOF/MS总离子流图

图2 psoralenol和corylifol C ESI-MS裂解途径

序号时间(min)鉴定结果分子式[M+H]+m/z测量值理论值偏差(ppm)[M+Na]+m/z11)7．441psoralenC11H6O3187．0393187．0395-1．93209．029221)7．905IsopsoralenC11H6O3187．0397187．0395-3．91209．029831)7．943coumestrolC15H8O5269．0449269．0444-1．63290．994741)8．336psoralenolC20H18O5339．1226339．12270．24361．112851)10．932corylifolCC20H18O5339．1233339．1227-1．8361．112061)12．553corylifolBC20H20O5341．1388341．1384-1．38363．128772)12．716elemicinC12H16O3209．1168209．11721．94231．103681)13．468neobavaisoflavoneC20H18O4323．1278323．12831．5345．117092)14．123myristicinC11H12O3193．0852193．08593．6215．1693101)14．410bavachinC20H20O4325．1429325．14341．65347．1330112)14．9225′⁃methoxydehydrodiisoeugenolC21H24O5357．1689357．17023．63379．2152122)15．021myrisisolignanC21H26O6375．1816375．1808-2．13397．1716131)15．929corylinC20H16O4321．1129321．1121-2．47343．1031141)16．520bavachromeneC20H18O4323．1284323．1283-0．3345．11178151)17．687CorylifolDC20H16O5337．1075337．1071-1．25359．0973162)19．7654⁃allyl-2⁃methoxyphenolC10H12O2165．0905165．0913．35187．0799171)20．932isobavachalconeC20H20O4325．1426325．14342．49347．1332182)21．928licarinAC20H22O4327．1577327．15914．28349．1470191)23．713corylifolAC25H26O4391．1895391．19042．35413．1793201)28．253bavachalconeC21H22O4339．1600339．1519-2．77361．1418211)33．816bakuchiolC18H24O257．1892257．19053．19279．1499

注：1)补骨脂中的成分，2)肉豆蔻中的成分。

以分子离子峰339为例，来说明鉴别过程。在碎片电压160 V条件下，峰4、峰5和峰20的分子离子峰均为339。但由于TOF精确分子量的特点，在此我们可以将峰20的分子离子峰339.160 0与峰4和峰5的分子离子峰339.122 6、339.122 7区分开来。峰20的元素组成为C21H22O4，通过与数据库匹配，可判定其为bavachalcone(补骨脂查耳酮)；峰4和峰5的元素组成均为C20H18O5，为一对同分异构体，psoralenol(补骨脂异黄酮醇)和corylifol C。为进一步区分这对同分异构体，调节碎片电压至360 V，得到此电压条件下的质谱图。峰4的质谱图上有明显的321.113 7[M-H2O]+, 293.100 1[M-H2O-CO]+，279.068 1[M-H2O-CO-CH2]+, 267.066 6[M-C4H8O]+，239.072 0[M-C4H8O-CO]+等碎片离子信息，推断出裂解途径见图2(a)所示。峰5的质谱图上有明显的283.062 6[M-C4H8]+，255.066 6[M-C4H8-CO]+，237.058 1[M-C4H8-CO-H2O]+，227.074 3[M-C4H8-CO-CO]+，297.082 5[M-C3H6]+等碎片信息，推断出裂解途径见图2(b)所示。结合以上信息，笔者能够鉴定峰4为psoralenol(补骨脂异黄酮醇)，峰5为corylifol C。采用类似的方法，能够对其他峰也进行相应的鉴别。

表2 二神丸化学成分中同分异构体的鉴别结果

4 结论

本实验采用RRLC-TOF/MS技术，实现了对二神丸中主要成分的快速定性分析。总共鉴定出21个活性成分，其中15种成分来自补骨脂,6种成分来自肉豆蔻。该技术为中药复方多成分分析提供了一种有效、可靠的方法，也同样适用于其它复杂体系的分析。

[1] 王 缙,付庆会. 宋明期间二神丸和五味子散两方的发展演变[J]. 四川中医,2010,28:115.

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2011-01-18

[修回日期] 2011-10-21

AnalysisonchemicalconstituentsofershenpillbyHPLC-TOF/MS

JI Song-gang1, WU Hai-tang2, MIAO Hua-yan3, WU Si2, LI Xiang2

(1.Department of Pharmacy, No.401 Hospital of PLA, Qingdao 266071，China; 2. School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433，China; 3.No.62370 PLA troop, Beijing 100071，China; 4. No. 62380 PLA troop, Beijing 100071，China)

ObjectiveTo analyze chemical constituents of ershen pill by rapid-resolution(high performance) liquid chromatography-time of flight mass spectrometry (HPLC-TOF/MS).MethodsA shelloseido column(3.0 mm×100 mm，3 μm) was used to separate. The mobile phase consisted of water containing 0.1% methane acid and acetonitrile was used as gradient elute. The flow rate was 0.6 ml/min. TOF/MS was applied for qualitative analysis under positive ion mode.ResultsUnder LC/MS condition, 21 major constituents in ershen pill were identified by time of flight mass spectrometry, among which, 15 constituents were from Psoralea corylifolia L,and 6 constituents were fromMyristicafragransHoutt.ConclusionA simple and reliable method using HPLC-TOF/MS was established to identify the chemical constituents of ershen pill.

ershen pill; HPLC-TOF/MS; chemica1 constituents

纪松岗(1964-)，男，博士，主任药师.E-mail:shanshan054340@163.com.

R917

A

1006-0111(2011)06-0435-03