肖琼，姜林，李晓瑾，王月娥

（1.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830054；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002；3.新疆医科大学附属中医院，新疆 乌鲁木齐 830054）

瘤果黑种草子的提取工艺优选△

肖琼1，2，姜林1，3，李晓瑾2*，王月娥1，2

（1.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830054；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002；3.新疆医科大学附属中医院，新疆 乌鲁木齐 830054）

目的：筛选瘤果黑种草子的最佳提取工艺条件。方法：以芦丁含量和醇提浸膏得率为指标，采用L9（34）正交试验法，考察醇提的工艺条件，即加醇量、提取时间、提取次数。结果：最佳提取工艺为加醇16倍，煎煮2次，每次1h。结论：该研究试验结果可靠，最佳工艺条件适合批量生产。

黑种草子；芦丁；正交试验；提取工艺

黑种草子系维吾尔族习用药材，为毛茛科植物瘤果黑种草Nigella glanduliferaFreyn.的干燥成熟种子［1］。黑种草子具有多种生理活性，如：抗菌［2］、抗氧化［3］、抗血小板聚集［4］、抗肿瘤、降脂、降糖、保肝作用［5］等。至今新疆已研制出用于治疗脱发、斑秃、头皮疹痒的复方斯亚旦生发油和酊两种制剂，疗效已在临床研究中得到证实［6］。近年来，已有一些关于黑种草子化学成分的报道，研究表明，黑种草子中除了富含挥发油和脂肪酸外，还含有黄酮类化合物［7］、皂苷类化合物［2］、生物碱类化合物［2］等有机化合物。文献报道该药材中具有黄酮类成分［2，7，8］，试验进行时，《中国药典》2010年版还未出版，《中国药典》2005年版中黑种草子项下无含量测定项，所以选择了较为常见的黄酮类成分芦丁为指标进行试验。本实验采用单因素考察结合正交试验的方法研究了影响瘤果黑种草子的主要因素，以浸膏得率和芦丁的含量为指标综合评价，筛选最佳提取工艺条件。

1 仪器与材料

LC-2010CHT型高效液相色谱仪（日本岛津公司），DK-S24电热恒温水浴锅，Metter AE163电子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）。

黑种草子购于新疆维吾尔自治区和田地区；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100080-200707）。甲醇（美国Fisher公司，色谱纯），磷酸（西安化学试剂厂，分析纯）。

2 方法与结果

2.1 芦丁含量测定方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Luna C18（100A，4.60 mm×250 mm，5μm），流动相：甲醇－0.1%磷酸溶液（40∶60），流速：l.0 mL·min－1，检测波长：360 nm，柱温：30℃，进样量：10μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品20.3 mg，置入100 ML容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密吸取该溶液5 mL，移入100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。色谱图见图1。

2.1.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约10 g，精密称定，精密加入60%乙醇80 mL，称定重量，加热回流60 min，放冷，再称定重量，用60%乙醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。色谱图见图2。

图1 芦丁对照品HPLC图

图2 瘤果黑种草子供试品HPLC图

2.1.4 线性范围考察 精密吸取上述对照品溶液2，4，6，8，10μL注入液相色谱仪，测定峰面积。以对照品峰面积为纵坐标（Y），对照品进样量为横坐标（X）进行线性回归，得回归方程C＝2×106A＋298.4（r＝0.999 9）。以峰面积（Y）为纵坐标，对标准溶液浓度（X）作图，绘制标准曲线，结果表明芦丁在0.02～0.1μg与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度考察

2.1.5.1 日内精密度 按2.1.2项下方法平行制备样品溶液，在同一天内连续进样5次，每次进样量10 μL，测定芦丁峰面积，计算RSD＝0.66%，结果表明日内精密度良好。

2.1.5.2 日间精密度 按2.1.2项下方法平行制备样品溶液，连续进样5 d，每天测定1次，每次进样量10μL，测定芦丁峰面积，计算RSD＝1.92%，结果表明日间精密度良好。

2.1.6 重复性考察 取醇提样品6份，按2.1.3项下方法平行制备样品溶液，测定芦丁峰面积，计算RSD＝1.77%，结果表明方法重复性符合分析要求。

2.1.7 稳定性试验 取醇提样品1份，按2.1.3项下方法平行制备样品溶液，在0，6，12，24，48 h分别精密吸取10μL滤液进样测定，记录芦丁的峰面积，计算RSD＝1.84%，结果表明48 h内芦丁样品较稳定。

2.1.8 加样回收率试验 取已知含量（0.61μg·mL－1）的供试品溶液2 mL，精密加入 10.15μg·mL－1的芦丁对照品溶液 0.5，1，1.5 mL混匀，按2.1.3项下制备方法和色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。

表1 芦丁加样回收率试验

2.2 工艺优化

采用单因素实验法对影响提取效果的提取次数、乙醇浓度、乙醇用量、提取时间进行考察，在此基础上固定乙醇浓度，再结合L9（34）正交试验法对提取次数、乙醇用量、提取时间进行进一步考察，以浸膏得率和芦丁的含量为指标综合评价，筛选最佳提取工艺条件。

2.2.1 单因素试验

单因素试验设计见表2。

表2 单因素试验设计

按醇提样品的制备方法，称取样品，按表2进行提取，分别测定芦丁含量及浸膏得率两个考察指标，按公式计算综合评分。综合评分＝（芦丁含量/最大芦丁含量） ×75＋（最小浸膏得率/浸膏得率）×25。结果见图3～6。

图3 提取次数对综合指标的影响

图4 乙醇用量对综合指标的影响

图5 提取时间对综合指标的影响

图6 乙醇浓度对综合指标的影响

从实验结果来看，60%乙醇综合评分最高，故选择60%乙醇提取。提取次数选择综合评分较高的1、2、3次3个水平进入正交试验，提取时间选择综合评分较高的1.0，1.5，2.0 h 3个水平进入正交试验，乙醇用量综合评分较高的16，18，20倍量3个水平进入正交试验。

2.2.2 正交试验 按L9（34）正交试验表安排实验，分别测定芦丁含量及浸膏得率两个考察指标，按公式计算综合评分。综合评分＝（芦丁含量/最大芦丁含量） ×75＋（最小浸膏得率/浸膏得率） ×25。结果见表3～5。

表3 正交试验设计因素水平表

表4 L9（34）正交试验设计表

表5 方差分析表

以芦丁含量及综合评分为指标的正交试验直观分析、方差分析结果表明，对醇提效果影响的大小顺序为C＞B＞A，其中提取次数对提取效果影响最大，提取时间次之，提取倍量对提取工艺的影响最小，提取次数对醇提效果的影响有统计学意义（P＜0.05）。综合芦丁含量及综合评分方差分析结果，优选醇提工艺条件为A2B3C2，即以18倍量，提取2次，每次2 h为醇提最佳工艺条件。

方差分析结果显示，提取倍量与提取时间不具有统计学意义，所以从大生产上节约能源、降低成本方面考虑，其最优提取工艺为：加入16倍量醇、回流提取2次，每次1 h。

2.2.3 最佳工艺验证试验 称取黑种草子10 g，加16倍量60%的乙醇，提取2次，每次1 h，分别测定2个考察指标，结果见表6，可见按优选的最佳工艺提取，有效成分提取率高，提取效果好，且工艺合理稳定。

表6 验证试验

3 讨论

在黑种草子提取工艺的筛选中，采用多指标综合评分法，相对单指标而言可使优化工艺的代表性更强。在醇提优化工艺的筛选中，以芦丁及浸膏得率为筛选指标，既反映了提取物中有效成分的含量，又反映出保健品预防疾病的物质基础—浸膏得率的多少。从正交试验及方差分析表中可以看出，浸膏得率所得到的筛选结果及影响程度的大小与芦丁含量及综合评分的结果不一致，因此，说明浸膏得率虽然能反映部分提取效果，但并不能完全说明提取效率的大小，因此，采用多指标评分法，符合药物制剂有效性和稳定性的要求，客观、全面地反映提取工艺的优劣。

影响中药材浸出效果的主要因素有溶剂种类、用量、浸出次数和提取时间，溶剂的选择是依据处方中药材有效成分的理化性质，故预试验对药材作了提取溶剂单因素考察，结果芦丁含量水提液低于醇提液，因此确定药材以乙醇作为提取溶剂。

［1］国家药典委员会.中国药典［S］.一部.北京：化学工业出版社，2005：241.

［2］倪君君，吴兆华，高慧媛，等.瘤果黑种草子的化学成分［J］.沈阳药科大学学报，2007，24（4）：215.

［3］井立萍，吴霞，陶海英，等.三种维吾尔药抗脂质过氧化作用的研究［J］.中草药，1999，30（7）：525.

［4］郭景珍，郝海峰，任丽娟，等.黑种草子油对大鼠体外血栓形成和抗血小板聚集的作用［J］.中药药理与临床，2000，16（5）：20.

［5］信学雷，薛慧清，阿吉艾克拜尔·艾萨，等.黑种草属植物研究进展［J］.时珍国医国药，2008，19（6）：1514.

［6］肖克来提·吐达洪，木哈巴提.维吾尔药黑种草的国内外应用简介［J］.中国民族医药杂志，2002，8（3）：28.

［7］郝海峰，任丽娟，陈玉武.黑种草子化学成分研究［J］.药学学报，1996，31（9）：689.

［8］艾尼娃尔·艾克木，张坚.HPLC法测定维药黑种草子中芦丁的含量［J］.新疆医学，2008，38（9）：247-248.

Study on Extraction Process of Xinjiang Characteristic Raw Material for Nigella Glandulifera Freyn.

XIAO Qiong1，JIANG Lin2，LIXiao-jin3，WANG Yue-e1
（1.Xinjiang Medical University，Urumqi 830054；2.The Affiliated Traditional Chinese Medical Hospital；Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；3.XinJiang Institute of Chinese traditionalmedica and ethicalmateria Medica，Urumqi 830002，China）

Objective：To screen the best extraction conditions forNigella glanduliferaFreyn..Methods：The optimum preparation process was investigated by L9（34）orthogonal design with the content of Rutin and extracta sicca yield as index.The chief factors influencing the extraction efficiency include ethanolconsumption，extracted time，extracted times.Results：The optimum extracting conditions was adding 16 times amount of ethanol，extracting 2 times and boiling for 1h each time.Conclusion：The result is credible.The optimal extracting conditions can be used for batch production.

Nigella glanduliferaFreyn.；Rutin；Orthogonal test；Extraction process

国家科技部支撑项目（2007BAI30B06）

*李晓瑾，Email：xjlxj＠126.com

2010-12-02）