林晓华，柯崇榕，吴毕莎，郑永标，李力，陈由强，黄建忠

1 福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心 生命科学学院 福建省现代发酵技术工程研究中心，福州 350108

2 福建师范大学生命科学学院 农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室，福州 350108

酿酒酵母SNF4基因敲除缺失菌株的构建

林晓华1*，柯崇榕1*，吴毕莎1，郑永标1，李力1，陈由强2，黄建忠1

1 福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心 生命科学学院 福建省现代发酵技术工程研究中心，福州 350108

2 福建师范大学生命科学学院 农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室，福州 350108

构建一株酿酒酵母 SNF4基因缺失菌株并研究其对乙醇产量的影响。扩增带有 SNF4基因上下游同源序列和Kanr筛选标记的SNF4基因敲除组件，转化到酿酒酵母YS2获得阳性克隆子，然后将质粒pSH65转到阳性克隆子中，半乳糖诱导pSH65表达Cre酶切除Kanr筛选标记，获得SNF4等位基因完全缺失菌株YS2-△SNF4。发酵实验结果表明，缺失菌株YS2-△SNF4乙醇产量较出发菌株提高了7.57%。利用Cre-LoxP系统，成功构建了SNF4等位基因完全缺失菌株并提高乙醇产生量。

酿酒酵母，SNF4，基因敲除

Abstract:Construction and ethanol production effects of SNF4 gene knockout in Saccharomyces cerevisiae were described in this paper. For knockout of SNF4 gene in S. cerevisiae YS2, a PCR-amplified disruption cassette was used, encoding the short flanking homologous regions to the SNF4 gene and Kanras selectable marker. The SNF4 gene disruption cassette was transformed into S. cerevisiae YS2 through LiAc/SS Carrier DNA/PEG. The positive transformants were grown on G418 plates and verified by PCR. The Kanrmarker was rescued by transforming plasmid pSH65 into positive transformants and inducing expression of Cre recombinase in galactose-containing medium. Lastly, the YS2-△SNF4 strain, in which SNF4 allele gene were completelyknocked out, was obtained by repeating the same procedure. The result of anaerobic fermentation showed that ethanol production of the SNF4 gene knockout strain had increased by 7.57 percent as compared with the original strain YS2. The experiment indicated ethanol production could be improved significantly with the approach of SNF4 gene knockout by Cre-LoxP system.

Keywords:Saccharomyces cerevisiae, SNF4, gene knockout

20世纪 80年代后，随着能源危机的加剧，生物燃料乙醇作为一种可再生的能源，备受各个国家的关注，构建高产乙醇的酿酒酵母工程菌株成为研究热点。近几年来，利用代谢工程技术对酿酒酵母进行遗传改造，控制乙醇生物合成代谢流，降低乙醇分解，已成为构建工程菌的重要方向之一[1]。参与乙醇代谢过程的乙醇脱氢酶系 (Adh1p-Adh5p)之一的 Adh2p是具有催化乙醇生成乙醛的功能[2]，产生葡萄糖阻遏效应。在发酵培养过程中，当环境中葡萄糖耗尽时，受葡萄糖阻遏的ADH2基因起始表达，从而利用乙醇作为碳源进行生长，导致乙醇产量的降低[3-4]。

Snf1蛋白激酶复合体是属于高保守的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶类家族，包括 Snf1p、Snf4p和Sip1p/Sip2p/Ga83p五个亚基，是受葡萄糖阻遏效应的基因的主要转录调控蛋白[5-7]。其中Snf4p对具有调节Snf1蛋白激酶的活性具有重要的功能。当环境中葡萄糖浓度高时，Snf1p自抑制使Snf1蛋白激酶处于非活性状态；当葡萄糖消耗殆尽时，Snf4p与其Snf1p催化区域相结合从而降低Snf1p的自抑制，激活 Snf1蛋白激酶活性，ADH2基因起始表达[8-10]。因此敲除SNF4基因，可以在降低ADH2基因的表达量，在一定程度上降低乙醇的利用率，提高乙醇产量。本研究采用Cre-LoxP系统、Kanr抗性标记和同源重组技术敲除SNF4基因，构建酿酒酵母SNF4等位基因缺失菌株并提高了酿酒酵母YS2的乙醇产量7.57%。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

酿酒酵母 YS2 (HIS3/URA3/LEU2/TRP1) 由福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心保藏，是一株工业乙醇生产菌株，原养型，双倍体；质粒pUG6、pSH65购自德国EUROSCARF，其中pUG6携带 Kanr筛选标记基因，两端带有 LoxP位点；pSH65携带Bler筛选标记基因，在半乳糖的诱导下能表达Cre酶。

1.1.2 酶和试剂

rTaq酶、限制性内切酶 Pst I、Xho I均购于TaKaRa公司；Pfu酶、G418、Zeocin购自上海生工；PEG3350及鲑鱼精DNA购于Sigma公司；其余试剂均为进口或国产分析纯。引物由 TaKaRa公司合成。

1.1.3 培养基

LB培养基 (%)：蛋白胨 1，氯化钠 0.5，酵母浸出物0.5。YPD培养基 (%)：酵母提取物1，蛋白胨2，葡萄糖2。YPG诱导培养基：即将YPD培养基中的葡萄糖改为半乳糖。发酵培养基 (%)：蔗糖17，酵母粉 0.8，KH2PO40.2，(NH4)2SO40.5，MgSO4·7H2O 0.2。

1.1.4 引物

根据SGD (Saccharomyces genome database) 数据库的 SNF4基因 (S000003083) 和 GenBank的pUG6序列 (Accession No. AF298793.1) 设计引物，所涉及的引物及其序列见表1。

1.2 方法

1.2.1 基因敲除组件的构建

利用碱裂解法制备质粒，以其为模板，以F1、R1为引物进行PCR扩增获得同源臂较短的SNF4基因敲除组件。以短同源臂的基因敲除组件为模板，以F2、R2为引物，PCR扩增获得同源臂较长的SNF4基因敲除组件。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.2.2 SNF4显性等位基因敲除菌株的构建

根据LiAc/SS Carrier DNA/PEG高效酵母转化法[11]，将SNF4敲除组件转入感受态酿酒酵母YS2。利用G418筛选与同源组件发生重组的克隆子，并以使用A-B、C-D、A-D、A-KanB、KanC-D引物进行PCR验证。采用pSH65质粒与YPG诱导、G418抗性筛选 Kanr抗性标记丢失克隆子，用 A-KanB、KanC-D、A-D引物进行 PCR验证。将阳性克隆连续传8~10代，诱导pSH65质粒丢失，最终获得SNF4显性等位基因的敲除菌株。

1.2.3 SNF4等位基因完全敲除菌株的构建

重复SNF4显性等位基因敲除步骤，敲除SNF4隐性等位基因，获得 SNF4等位基因完全敲除菌株YS2-SNF4△。

1.2.4 SNF4等位基因完全敲除菌株遗传稳定性

将YS2-△SNF4连续传18代，每36 h转接1次，随机挑取每一代酵母的单菌落使用A-D、A-B、C-D三对引物进行PCR验证，研究其遗传稳定性。

1.2.5 SNF4等位基因完全敲除菌株生长速率分析

以 1%的接种量分别接种 YS2和 YS2-△SNF4于50 mL YPD液体培养基，28 ℃、250 r/min振荡培养，每2小时取样检测其OD600值。

1.2.6 SNF4等位基因完全敲除菌株乙醇产量分析

将YS2、YS2-△SNF4接种到100 mL液体发酵培养基，28 ℃摇床培养 (0~8 h：好氧培养，8 h后发酵结束：静置厌氧培养)，每隔 12小时取样，检测残糖量和发酵液中乙醇含量[12]。

2 结果与分析

2.1 酿酒酵母 YS2中 SNF4基因的克隆和序列分析

利用玻璃珠法提取 YS2基因组[13]，以基因组DNA为模板，用引物A-D扩增获得SNF4基因全长(GenBank Accession No. HQ386858 )。Blast分析表明，Saccharomyces cerevisiae YS2的SNF4基因与Saccharomyces cerevisiae S288c的SNF4基因 (SGD No. S000003083) 具有很高的同源性。

2.2 SNF4等位基因敲除组件的构建

以F1、R1为引物，利用PCR获得带有2个LoxP位点和Kanr筛选标记基因片段，结果表明大小与理论预计 (1 690 bp) 一致。以F2、R2为引物，PCR扩增到具有同源臂较长的SNF4等位基因敲除组件，结果表明大小与理论预计 (1 715 bp) 一致，SNF4等位基因敲除组件构建成功。

2.3 SNF4显性等位基因敲除菌株的验证

PCR验证结果 (图1) 可知，在出发菌株YS2中，泳道1~3条带大小与预期大小 (542 bp、1 603 bp、951 bp) 一致，表明YS2中存在SNF4基因。在转化克隆子中，泳道6有2条带，泳道7~8均有单一条带并与理论值 (2 200、1 600、1 076、928 bp) 相符，表明酿酒酵母YS2基因组中SNF4显性等位基因已经与敲除组件发生了正确的同源重组，成功敲除了SNF4显性等位基因。然而，泳道4~6均有与SNF4基因大小相一致的条带，表明转化克隆子中还存在SNF4隐性等位基因。

图1 筛选阳性克隆子Fig. 1 Screening for positive clones. M: 200 bp marker; 1,5: A-B; 2,6: A-D; 3,4: C-D; 7: A-KanB; 8: KanC-D.

2.4 Kanr筛选标记的切除

pSH65质粒转到阳性克隆子中，在YPG的诱导下会产生Cre重组酶，切除方向相同的2个LoxP位点间的序列，留下1个LoxP位点。通过平板影印技术和G418抗性筛选，可从YPD平板上获得抗性标记丢失的菌株 (图2)，使用引物A-KanB、KanC-D、A-D进行验证 (图3)，其中用A-KanB、KanC-D引物没有条带出现，用A-D得到的目的条带大小与预测的结果 ((746+1 603) bp) 一致，说明了Kanr已被正确切除。

图2 G418抗性丢失细胞的筛选Fig. 2 Selection of cells without G418 resistance. Left: YPD plate; right: YPD+G418 plate.

图3 SNF4单倍体缺失菌株Kanr基因的验证Fig. 3 Verification of SNF4 haploids with Kanrlost. M: 200 bp marker; 1: A-KanB; 2: KanC-D; 3: A-D.

2.5 SNF4等位基因的完全敲除与验证

采用相同的转化和筛选方法敲除SNF4隐性等位基因，切除Kanr筛选标记，用引物A-B、C-D、A-D验证阳性克隆子，电泳结果 (图4) A-B、C-D没有克隆出条带，A-D得到的条带与理论值 (746 bp) 一致。将A-D得到的PCR产物连接到PMD-18T载体上测序，与SGD上的序列比对，结果一致。表明酿酒酵母YS2的SNF4等位基因已经完全被敲除。

图4 SNF4二倍体缺失菌株的验证Fig. 4 Verification of diploid with SNF4 lost. M: 200 bp marker; 1: A-D product of PCR; 2: A-B product of PCR; 3: C-D product of PCR.

2.6 缺失菌株YS2-△SNF4的遗传稳定性

在连续传代 18代的缺失菌株中，随机挑取 98个单菌落进行PCR验证。结果 (表2) 表明：A-B、C-D均没有克隆出任何条带，A-D均可得到预期的条带，表明所构建的缺失菌株 YS2-△SNF4具有很高的遗传稳定性。

表2 缺失菌株YS2-△SNF4的遗传稳定性Table 2 Genetic stability test of YS2-△SNF4

2.7 细胞的生长情况

液体平行培养YS2和YS2-△SNF4菌株，绘制生长曲线 (图5)。从图中可以看出，在生长的前期 (0~34 h)，YS2-△SNF4比 YS2生长速度慢，但在后期 (36 h之后)，两株菌的生长速率基本一致。

图5 YS2-△SNF4和YS2生长曲线Fig. 5 Culture curve of YS2 and YS2-△SNF4.

2.8 乙醇发酵的试验

对YS2和YS2-△SNF4分别进行静置厌氧发酵，用 DNS法测残糖量和用气相色谱分析乙醇含量(图6)。结果说明，缺失菌株YS2-△SNF4和出发株YS2在96 h时乙醇产量均为最高，YS2-△SNF4可达8.38% (V/V)，比YS2 (7.79%) 提高了 7.57%。96 h 后葡萄糖消耗殆尽，YS2-△SNF4发酵液乙醇含量基本不变，而YS2菌株发酵液乙醇含量却下降了 2.46%。以上结果表明，缺失菌株 YS2-△SNF4在葡萄糖阻遏效应后的乙醇消耗能力降低了。

图6 厌氧发酵残糖量和乙醇的变化图Fig. 6 Changes in reducing sugar and ethanol production during anaerobic fermentation of the YS2 and YS2-△SNF4.

3 讨论

基因敲除技术是20世纪80年代发展起来的一项新型的分子生物学技术，它能应用于特定突变的工程菌的构建，与代谢工程相联系，可改变细胞的代谢流向，阻断代谢支路来提高产量，从而达到生物育种的目的[14-15]。如醛脱氢酶基因 (ALDH) 的敲除使克氏肺炎杆菌合成1,3-丙二醇的浓度提高了27%~42%[16]，敲除黑曲霉的 MNN9基因，使外源蛋白漆酶的分泌表达提高 14%[17]。另外，利用Cre-LoxP系统的基因敲除方法，可以重复利用抗性标记基因，解决了工业酿酒酵母有效筛选标记的缺乏问题。

在酿酒酵母中，基因敲除对其细胞的生长情况具有一定的影响[18]。YS2-△SNF4基因缺失突变株与出发菌株 YS2相比，在生长初期，突变株的生长速度较慢，这与Aon、Lin等的报道一致[19-20]。说明SNF4基因对于维持酿酒酵母正常生长起到一定的作用，敲除后细胞的生长能力减弱。在耗糖方面，突变株在初期消耗速度较慢，可能是生长速度较慢导致的，但是在 84~96 h时，葡萄糖消耗殆尽，YS2和YS2-△SNF4两株菌株的乙醇的产量达到最高。此后，缺失菌株 YS2-△SNF4乙醇的含量基本上保持稳定，而出发菌YS2的乙醇含量则逐渐下降，开始利用以乙醇作为碳源进行生长。这说明当葡萄糖消耗殆尽，SNF4基因缺失菌株在一定程度上影响了Snf1蛋白激酶复合体的活性[5,21]，减少了 ADH2基因的表达量，即不能利用乙醇作碳源，减弱乙醇至乙醛的分支代谢作用[21]，阻止乙醇再次被利用的可能性，进而提高了乙醇的产量。

酿酒酵母的代谢调控网络非常精细，基因间相互联系，具有很强的调控能力。SNF4基因不仅对ADH2基因具有调控作用，另外对ALD6、SFA1、CAT8等基因存在一定的联系[6,22]，因此，单一敲除 SNF4基因在一定程度上可以提高乙醇的产量，但要想进一步提高乙醇的产率，可以通过原生质体融合优良的菌种或连续敲除几个相关基因来实现。

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Construction of Saccharomyces cerevisiae mutant with knockout of SNF4 gene

Xiaohua Lin1*, Chongrong Ke1*, Bisha Wu1, Yongbiao Zheng1, Li Li1, Youqiang Chen2,and Jianzhong Huang1
1 Engineering Research Center of Industrial Microbiology, Ministry of Education, Engineering Research Center of Fujian Modern Fermentation Technology, College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, China
2 Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Ministry of Agriculture, College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou
350108, China

Received: August 3, 2010; Accepted: December 16, 2010

Supported by: Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (No. nycytx-024-01-20), National Department Public Benefit Research Foundation (No. nyhyzx07-019), 948 Ministry of Agriculture Project (No. 2006-G37), Fujian Provincial Development and Reform Commission (No. [2004]477), Fujian Provincial Department of Science and Technology (No. 2005Q007).

Corresponding author: Jianzhong Huang. Tel/Fax: +86-591-22868212; E-mail: hjz@fjnu.edu.cn*These authors contributed equally to this study.

现代农业产业技术体系建设专项资金 (No. nycytx-024-01-20)，公益性行业 (农业) 科研专项项目 (No. nyhyzx07-019)，农业部948项目 (No.2006-G37)，福建省发改委重大项目 (No. [2004]477)，福建省科技厅平台建设项目 (No. 2005Q007) 资助。