高玉龙，孙芬芬，侯磊，高宏雷，祁小乐，刘娣，华育平，王笑梅 黑龙江省农业科学院博士后工作站，哈尔滨 50086 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 5000 东北林业大学博士后流动站，哈尔滨 50040

鸡法氏囊B淋巴细胞中与鸡传染性法氏囊病病毒VP2相互作用蛋白筛选

高玉龙1,2,3，孙芬芬2，侯磊2，高宏雷2，祁小乐2，刘娣1，华育平3，王笑梅2
1 黑龙江省农业科学院博士后工作站，哈尔滨 150086
2 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150001
3 东北林业大学博士后流动站，哈尔滨 150040

为了获得鸡法氏囊B淋巴细胞中与鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV) VP2相互作用的蛋白质，利用酵母双杂交系统，用IBDV VP2蛋白为诱饵蛋白，筛选鸡法氏囊B淋巴细胞cDNA表达文库。将表达文库质粒转化含IBDV VP2诱饵质粒的酵母感受态细胞，检测报告基因在相应的营养缺陷型培养基 (SD/-Leu/-Trp/-His) 上表达情况，进一步经β-半乳糖苷酶报告基因检测，筛选到16个阳性克隆。提取阳性克隆质粒，经测序分析获得5个原鸡基因序列，分别是：线粒体DNA、蛋白质O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化转移酶、肿瘤蛋白p53结合蛋白、微管解聚相关蛋白质和软骨蛋白硫酸GalNAcT-2。Co-IP试验进一步证实VP2蛋白能够与肿瘤蛋白p53结合蛋白、蛋白质O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化转移酶和软骨蛋白硫酸蛋白相互作用。为研究IBDV与宿主细胞相互作用以及细胞受体筛选奠定了基础。

传染性法氏囊病病毒，B淋巴细胞，cDNA表达文库，蛋白相互作用，酵母双杂交

Abstract:To screen the interactive proteins with IBDV Gt VP2 protein from cDNA library of B Lymphoid cells of the bursa of fabricius. The expression cDNA library plasmids was transformed to the yeast competent cells, which have the bait plasmid-Gt VP2. After testing for growth in synthetic complete medium lacking histidine and uracil and for production of β-galactosidase(X-gal), we obtained 16 positive clones. We searched the gene sequences of positive clones in the NCBI website. The blast results showed that five positive clones were the gallus sequences. They were Gallus gallus breed mitochondrial DNA, O_GlcNAc transferase, Tumor protein p53 binding protein, Stathmin and Chondroitin sulfate GalNAcT-2, respectively. This study is helpful for the further identifying the receptors of IBDV in B Lymphoid cells of the bursa of fabricius.

Keywords:infectious bursa disease virus (IBDV), B Lymphoid cells, cDNA expression library, protein-protein interactions, yeast two-hybrid system

鸡传染性法氏囊病 (Infectious bursal disease，IBD) 是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV) 引起的一种急性、高度接触性、病毒性传染病。IBDV属于双 RNA病毒科(Birnaviridae) 禽双RNA病毒属 (Avibirnavirus)。法氏囊是IBDV感染宿主及其复制的组织基础，IBDV的易感细胞为法氏囊B淋巴细胞，IBDV感染鸡后，首先在法氏囊B淋巴细胞中复制、增殖，进而引起发病，导致严重的免疫抑制[1]，以致诱发多种疾病或引起多种疫苗免疫失败[2-4]。

VP2蛋白是IBDV的主要宿主保护性抗原，具有一个构象依赖性的中和抗原决定簇，可诱导机体产生中和抗体，是病毒的主要衣壳蛋白，构成病毒的外表面，决定病毒毒力和细胞嗜性[5-6]。研究发现，VP2蛋白的206~350位氨基酸是影响病毒与细胞受体相互作用的位点[7]，所以推测其与宿主细胞作用及病毒感染有密切关系[8]。对IBDV的晶体结构研究表明，几个嗜性决定簇定位于VP2蛋白顶端，暴露于最外侧，推测这些氨基酸残基直接与细胞受体相互作用[9]。为了研究IBDV与宿主细胞的相互作用，筛选法氏囊B淋巴细胞上与VP2蛋白相互作用的蛋白，本研究利用酵母双杂交系统，以IBDV Gt VP2蛋白为诱饵蛋白，从鸡法氏囊B淋巴细胞cDNA表达文库中筛选与其相互作用的蛋白质分子，为鉴定IBDV细胞受体、研究IBDV与宿主细胞相互作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株及主要试剂

酵母双杂交表达载体 pDESTTM32、Mav203酵母菌株、鲑鱼精 DNA、酵母质粒小提试剂盒、BP ClonaseTMEnzyme Mix、LR ClonaseTMEnzyme Mix均购自美国 Invitrogen公司；各种营养缺陷型培养基、X-gal、二甲基甲酰胺 (DMF)、3-Aminotriazole(氨基三唑) 购自 Clontech公司；大肠杆菌 E. coli DH5α为本实验室保存；pMD18-T、2×HotStart Taq PCR MasterMix购自TaKaRa公司。HRP标记羊抗鼠IgG二抗、硝酸纤维素膜、Flag单克隆抗体均购自Sigma公司。

1.2 酵母感受态制备及文库质粒转化

携带有 IBDV VP2诱饵质粒 (pDESTTM32-GtVP2) 的酵母菌Mav203为本实验室构建保存[10]。接种该菌株于 250 mL 三角烧瓶中，加 20 mL SD/-Leu液体培养基，30 ℃过夜培养。次日稀释至300 mL SD/-Leu液体培养基中 (OD600=0.1)，继续摇至OD600=0.5。室温下2 500 r/min离心8 min，弃上清；30 mL无菌水重悬沉淀，室温下2 500 r/min离心 5 min，弃上清。沉淀悬于 1.5 mL 1×乙酸锂(LiAc)/0.5×TE，室温孵育10 min。将上述感受态细胞悬液分装到30个1.5 mL EP管中，每管50 µL。加1 µg表达文库质粒[11]和5 µL高质量灭活的鲑鱼精 DNA 于每个 EP管中，加 300 µL 1×LiAc/40%PEG-3350/1×TE到每管，30 ℃水浴30 min。每管中加 40 µL 二甲基亚砜 (DMSO)，42 ℃作用 10 min。将30管转化菌液分别涂布于30个15 cm SD/-Trp/-Leu/-His/30 mmol/L 3AT平板，30 ℃培养4 d，待酵母菌长到3 mm左右备用。

1.3 β-半乳糖苷酶 (X-gal) 活性的检测

观测转化平板上阳性克隆的生长，其间逐步将生长出的阳性克隆全部划线到 SD/-Trp/-Leu筛选平板上，同时每个平板分别设强阳性、弱阳性和阴性对照酵母菌，制作Master平板，30 ℃培养24 h。然后将其转印到灭菌NC膜上，将膜放入YPAD平板上，30 ℃培养 18~24 h。称取 10 mg X-gal溶于 100 µL DMF，加 60 µL β-巯基乙醇和 10 mL Z buffer，取 2层直径为125 mm的滤纸浸入上述溶液，将多余的液体吸出。将长出菌落的NC膜置于液氮中10~30 s后取出恢复至室温，将其平铺在浸泡有 X-Gal缓冲溶液的滤纸上，放于37 ℃温箱孵育过夜。将呈现蓝色的克隆在 SD/-Trp/-Leu选择平板上连续划线培养1次后，再次进行X-gal试验以进一步排除假阳性。

1.4 阳性克隆鉴定及基因信息分析

对X-gal试验为阳性的酵母菌，从Master板上挑菌摇于5 mL的SD/-Trp/-Leu液体培养基中，用酵母质粒小提试剂盒提取酵母质粒。取5 µL质粒，用相应载体引物进行PCR扩增，扩增产物胶回收后连接到 pMD18-T载体上，挑取阳性克隆进行序列测定。利用Blast分析基因信息。

1.5 相互作用蛋白Co-IP验证

分别将酵母双杂交筛选到的候选基因克隆到pCAGGS的多克隆位点，构建真核表达质粒，其C末端引入Flag标签，同时构建IBDV VP2基因的真核表达质粒。经酶切鉴定及测序正确的阳性克隆，提取质粒后分别与VP2真核质粒共转染Vero细胞，培养48 h后，用700 µL细胞裂解液裂解细胞，4 ℃、12 000 r/min离心7 min，吸取上清置一新的EP管中，加入10 µL Protein G后，加抗VP2单克隆抗体7 µL，4 ℃低速旋转过夜，次日4 ℃、12 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL裂解液重悬，离心后弃上清，加入15 µL 2×SDS上样缓冲液，运行SDS-PAGE后转印到NC膜，用抗Flag单克隆抗体作为一抗，二抗用HRP标记的抗鼠IgG二抗，进行Western blotting分析。

2 结果与分析

2.1 鸡法氏囊B淋巴细胞cDNA文库筛选

将cDNA表达文库质粒转化入Mav203酵母菌(含有诱饵质粒pDESTTM32-VP2)，在SD/-Trp/-Leu/-His/30 mmol/L 3AT筛库平板上有200多个阳性克隆，将生长出的阳性克隆全部接种到SC-Trp-Leu营养缺陷型平板制作Master板，生长3~4 d后，进行X-gal显色反应，初步筛到16个阳性克隆，见图1。

图1 X-gal蓝斑显色试验结果Fig. 1 Results of LacZ reporter gene.

2.2 阳性克隆的PCR鉴定

将X-gal筛选的16个阳性克隆用酵母质粒小提试剂盒提取质粒，并用Prey质粒重组位点两端引物进行PCR扩增，以0.8 g/L的琼脂糖凝胶电泳，结果表明从 1、2、3、4、10和12号质粒共扩增得到6个不同的基因片段 (图2)，其他质粒为假阳性。

2.3 阳性克隆测序及基因信息分析

将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体进行序列测定，测序结果进行Blast同源性比对。结果发现，筛选到的文库质粒cDNA插入片段均为已知原鸡序列，与原鸡序列同源性均在99%以上。其中4号和12号质粒为同一个基因，是原鸡线粒体DNA。其他基因编码不同蛋白，详细结果见表 1。对这 5个蛋白进行了跨膜结构预测分析，结果表明 5个蛋白均没有跨膜区，其中软骨蛋白硫酸GalNAcT-2存在一个信号肽区。

图2 酵母质粒PCR电泳图Fig. 2 PCR products of yeast positive plasmids. 1: No. 10 plasmid; 2: negative control; 3: No. 12 plasmid; 4: No. 1 plasmid; 5: No. 4 plasmid; 6: No. 2 plasmid; 7: No. 3 plasmid;8: pDEST22 control; M: 1 kb DNA marker.

表1 法氏囊B淋巴细胞中与IBDV VP2蛋白相互作用蛋白生物学信息Table 1 Biology information of proteins of B lymphocyte of bursa interacting with IBDV VP2

2.4 Co-IP试验结果

免疫共沉淀试验可用于检测蛋白之间的相互作用，为了进一步验证酵母双杂交筛选到的候选蛋白与IBDV VP2蛋白相互作用，分别构建了带Flag标签的真核表达质粒，分别与VP2共转染Vero细胞后进行Co-IP检测，结果见图3。肿瘤蛋白p53结合蛋白 (泳道1)、蛋白质O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化转移酶 (泳道2) 和软骨蛋白硫酸GalNAcT-2 (泳道4)均出现了与预期大小一致的蛋白条带，表明VP2蛋白可以分别与它们作用，将其沉淀下来，而VP2蛋白不能沉淀微管解聚相关蛋白 (泳道5)。

图3 免疫共沉淀检测结果Fig. 3 Results of Co-IP assay. 1: tumor protein p53 binding protein+VP2; 2: O_GlcNAc+VP2; 3: marker; 4: chondroitin sulfate GalNAcT-2+VP2; 5: stathmin+VP2; 6: vero cell only; 7:VP2 only.

3 讨论

病毒能否吸附到相应的细胞是该病毒能否完成感染的关键环节。病毒与细胞特异性结合的本质是病毒蛋白(配体)与细胞膜表面特定蛋白 (受体) 的特异性结合[12]。病毒粒子上与细胞受体结合的蛋白质 (配体)，一般都是病毒表面蛋白。VP2蛋白是IBDV的主要衣壳蛋白，构成了 IBDV的外表面。IBDV的配体主要集中在VP2蛋白，推测其与宿主细胞作用及病毒感染有密切关系[12]。所以本研究选取IBDV VP2蛋白为诱饵蛋白来筛选鸡法氏囊B淋巴细胞 cDNA表达文库。希望从中筛选到与 IBDV相互作用的蛋白，为研究病毒与宿主细胞相互作用以及IBDV细胞受体筛选奠定基础。

本研究利用酵母双杂交系统从鸡法氏囊B淋巴细胞cDNA表达文库中筛选到16个阳性克隆，经反复筛选及序列测定得到5个不同的候选基因，均为原鸡序列。它们分别为线粒体 DNA (Gallus gallus breed mitochondrial DNA)、蛋白质O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化转移酶 (O_GlcNAc transferase)、肿瘤蛋白 p53结合蛋白 (Tumor protein p53 binding protein)、微管解聚相关蛋白质 (Stathmin) 和软骨蛋白硫酸GalNAcT-2 (Chondroitin sulfate GalNAcT-2)。肿瘤蛋白 p53是一种核蛋白，其在调控细胞周期中起重要作用。该蛋白包含DNA结合寡聚化域和转录激活域，肿瘤蛋白 p53蛋白与结合位点结合后，形成四聚体结构，激活下游基因的表达，从而抑制细胞生长[13]。软骨蛋白硫酸 GalNAcT-2广泛分布于高尔基体中，其能与金属离子结合，具有转移酶功能[14]。微管解聚相关蛋白 (Stathmin)，是脊椎动物细胞中普遍存在的胞质内可溶性磷蛋白，能够高效调节细胞的增殖与分化[15-16]。蛋白质 O_GlcNAc糖基化转移酶促进蛋白质的O-GlcNAc糖基化，在蛋白质-蛋白质相互作用的调节中发挥着重要的作用[17]。

为了进一步在体外验证这些蛋白与 IBDV VP2蛋白的相互作用，本试验又分别构建了真核表达质粒，进行了Co-IP试验，结果表明VP2蛋白能够将肿瘤蛋白p53结合蛋白、蛋白质O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化转移酶和软骨蛋白硫酸蛋白沉淀下来，进一步证实了它们能够相互作用。而与微管解聚相关蛋白的Co-IP试验，我们重复了3次，VP2蛋白均不能将其沉淀下来，推测这两个蛋白不能够相互作用，酵母双杂交结果可能为假阳性。

跨膜结构预测分析表明这几个蛋白均没有跨膜区，不是膜蛋白，那么这些蛋白是怎样与IBDV VP2蛋白相互作用、在IBDV感染B淋巴细胞中充当什么角色还不清楚，还有待于进一步研究。

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Screening proteins interacting with infectious bursa disease virus Gt VP2 from cDNA library of B lymphoid cells of the bursa of fabricius

Yulong Gao1,2,3, Fenfen Sun2, Lei Hou2, Honglei Gao2, Xiaole Qi2, Di Liu1, Yuping Hua3,and Xiaomei Wang2
1 Postdoctoral Research Center, Heilongjiang Academy of Agriculture Science, Harbin 150086, China
2 State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001, China
3 Postdoctoral Research Station, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China