张涛 陈磊 张怡靓 李楚彦 陈仁义

星形胶质细胞活化会释放某些炎症因子及细胞因子与神经元相应受体结合，增强神经元兴奋性[1]，从而在神经病理性痛中发挥重要作用[2]。炎性痛与神经病理性痛具有不同的发病机制[3]，因此本实验以完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant，CFA)诱导炎性痛动物模型，观察脊髓背角星形胶质细胞在CFA致痛模型中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料220～250 g雄性SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供。

1.2 主要仪器和试剂机械痛敏测试仪(North Coast公司);热痛敏测试仪(西安博邦化工有限公司);Real-time PCR反应体系及水平电泳槽(Bio-Rad公司);胶原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)PCR引物(正义链:5'-AGAGGGACTTCCATCCACTG-3'反义链:5'-GGTTGTGGACTCTTCCAGGT-3'南京金斯瑞生物科技有限公司);CFA，L-α-aminoadipate(LAA)及Real-time PCR试剂盒(Sigma公司)。

1.3 实验分组及给药SD大鼠随机分为3组(n=6/组):CFA组(以60 mg/kg剂量腹腔注射4%戊巴比妥钠麻醉大鼠，俯卧位固定于手术台上，于左下肢足底注射100 μl CFA诱导炎性痛模型，同时参照文献[3]行鞘内置管术，术后6 d鞘内给予生理盐水10 μl);LAA组(处理方式同CFA组，但鞘内给予LAA溶液10 μl);对照组(处理方式同CFA组，但足底及鞘内均给予生理盐水)。LAA药物配置:以生理盐水配制，浓度为100 nmol/10 μl。

1.4 疼痛阈值的检测参照文献所述方法[2]，于术前2 d及术后7 d运用von Frey丝检测大鼠左后肢足底机械性痛域，运用Hargreaves热辐射法检测大鼠左后肢足底热痛阈。

1.5 Real-time PCR检测大鼠脊髓背角GFAP mRNA变化行为学测试之后，腹腔注射4%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠(60 mg/kg)，剥离脊髓腰膨大，分离腹背侧，参照文献[4]反转录脊髓背角GFAP mRNA，利用公式2-deltadeltaCt分析数据结果。

1.6 统计学方法数值以均数±标准差表示，利用SPSS 17.0软件行单因素方差分析LSD检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 鞘内注射LAA可缓解CFA大鼠左后肢足底炎性痛术前2 d各组左后肢足底热痛阈及机械痛域无明显差别(P＞0.05)。术后7 d，CFA组左后肢足底机械痛及热痛阈值较对照组明显降低(P＜0.01)，出现了明显的炎性痛表现;鞘内注射LAA可缓解CFA大鼠左后肢足底炎性痛，LAA组左后肢足底机械痛及热痛阈值较CFA组明显升高(P＜0.01)(表1，表2)。

表1 各组大鼠左后肢足底机械痛阈值

表2 各组大鼠左后肢足底热痛阈值(S)

2.2 鞘内注射LAA抑制CFA大鼠脊髓背角星形胶质细胞活化GFAP是星形胶质细胞活性标志物。Real-time PCR检测显示，CFA组大鼠脊髓背角星形胶质细胞明显活化，GFAP mRNA较对照组升高15.1%(P＜0.01)。鞘内注射LAA可抑制CFA大鼠脊髓背角星形胶质细胞活化，LAA组GFAP mRNA较CFA组下降16.2%(P＜0.01)(图1)。

图1 鞘内置管7 d各组大鼠脊髓背角GFAP mRNA。＊＊与对照组相比，P＜0.01;##与CFA组相比，P＜0.01

3 讨论

传统理论认为，神经元的结构和功能异常导致了痛觉的产生和持续，关于炎性痛的发病机制及治疗研究也一直围绕着神经元进行，但最近有研究表明，胶质细胞可能参与了神经病理性痛的产生与维持[2]，这为神经病理性痛提出了新的研究方向，也为炎性痛提供了新的研究思路。炎性痛与神经病理性痛发病机制不同[3]，本研究以CFA诱导的炎性痛大鼠为研究对象，观察了该模型7 d痛觉阈值及脊髓背角GFAP(星形胶质细胞活性标志物)的mRNA变化。结果表明，大鼠足底注射CFA 7 d出现了明显的神经病理性痛表现，脊髓背角GFAP mRNA显著增高，星形胶质细胞活化。LAA是星形胶质细胞活性特异性抑制剂。本研究显示，LAA明显抑制了CFA大鼠脊髓背角星形胶质细胞活化，LAA组GFAP mRNA较CFA组明显降低，LAA也显著缓解了CFA大鼠炎性痛。研究结果提示脊髓背角星形胶质细胞活化参与了CFA诱导的炎性痛。

本实验没有对脊髓背角星形胶质细胞参与CFA炎性痛的机制进行研究，但有研究表明，星形胶质细胞活化可释放一氧化氮、兴奋性氨基酸等炎症因子和白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α等细胞因子，这些炎症因子和细胞因子可与神经元相应受体结合，从而提高神经元兴奋性[1]，星形胶质细胞活化还可以上调神经元谷氨酸受体的表达，增加神经元兴奋性[5]，这些都可能是星形胶质细胞参与CFA诱导的炎性痛机制。

[1]Milligan ED，Watkins LR.Pathological and protective roles of glia in chronic pain.Nat Rev Neurosci，2009，10:(1):23-36.

[2]Watkins LR，Milligan ED，Maier SF.Spinal cord glia:new players in pain.Pain，2001，93(3):201-205.

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