韦桂宁，何德明，宋大彦，李艳，梁宁生#(.广西医科大学附属肿瘤医院，南宁市5002；2.广西中医药研究院，南宁市50022；.石家庄医学高等专科学校药理教研室，石家庄市05008)

近年来，无论在国内还是国外，真菌感染率均有上升的趋势，严重地威胁着人类的健康。与抗细菌感染药物相比，抗真菌药物存在种类少、选择性小、毒副作用大的缺点[1]，故加紧研究和开发新型高效、低毒、广谱的抗真菌药物迫在眉睫。脊椎动物除天然拥有一整套高度特异性的、以细胞为核心的免疫系统外，还拥有一套由不同的抗菌蛋白/肽组成的高效、广谱的防御系统。与传统的抗生素相比，抗菌蛋白/肽具有杀菌快速、广谱且致病菌很难对其产生抗药性等优点[2，3]。

本文以大鼠为实验动物，腹腔注射金黄色葡萄球菌诱导产生细菌性感染的炎症模型，收集其腹腔炎症渗出液，经过离心得到富含蛋白的上清液。以常见的真菌如白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌为研究目标，研究该上清液对真菌的杀菌作用。观察温度对该上清液抗白色念珠菌作用的影响，并在显微镜下观察该上清液对白色念珠菌的杀灭过程。由此，为新型天然抗真菌药物的研究提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

THZ-C恒温振荡器、HWS-20恒温水浴箱(江苏太仓市实验设备厂)；隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械一厂)；721分光光度计(上海第三分析仪器厂)；显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 试药

RPMI-1640培养基(美国Gibco-Brl公司)；LB培养基粉(上海生工生物工程有限公司)；沙保罗氏琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司)；小牛血清白蛋白(BSA，武汉生命技术有限公司分装)。

1.3 动物

Wistar大鼠，♂，体重(300±50)g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物许可证号:SCXK桂2003-0003。

1.4 菌株

金黄色葡萄球菌(广西医科大学微生物学教研室，批号:ATCC26003)；白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌(均从广西医科大学附属肿瘤医院疑似相应念珠菌感染的8名患者身上分离得到，菌株分离纯化后经鉴定确认)。

2 方法

2.1 金黄色葡萄球菌液的制备

制备对数生长期金黄色葡萄球菌，即挑取少量菌种接种于新鲜LB培养液中，37℃、190 r·min－1振摇过夜。将过夜培养液按1∶50接入新鲜LB培养液中，37℃、190 r·min－1振摇，2.5 h后将培养液取出，4000 r·min－1离心50 s，弃上清液，用生理盐水稀释后，用吸光度法测定金黄色葡萄球菌液菌落数，然后用生理盐水稀释成所需的浓度，待用。

2.2 建模[4]

取大鼠20只，随机分为模型组和正常对照组，每组10只。模型组大鼠腹腔注射金黄色葡萄球菌液(3.6×108cfu·mL－1)建立细菌性感染模型，于24 h后处死大鼠，打开腹腔，收集腹腔渗出液，即细菌性腹腔炎症渗出液(简称渗出液)。将收集的渗出液1000 r·min－1离心5 min，收集上清液，即细菌性腹腔炎症渗出液的上清液(简称上清液)。沉淀的细胞部分用生理盐水冲洗3次，最后用RPMI-1640反应液(20 mol·L－1羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)、1%小牛血清白蛋白、2.5 mol·L－1氯化钙，pH7.4)稀释到原来的容积，即得细菌性腹腔炎症渗出液的细胞液(简称细胞液)。正常对照组除注射生理盐水外，其余操作同模型组。

2.3 渗出液、细胞液、上清液对白色念珠菌的杀菌试验

根据文献[5]，采用琼脂铺板计数法，具体步骤如下:(1)取过夜培养的白色念珠菌菌液，按1∶50加入新鲜LB培养液中，在37℃摇床中振摇孵育5～8 h(对数生长期)。(2)离心收集白色念珠菌，同时将渗出液、细胞液、上清液分别稀释成20%、4%、0.8%，再将上述稀释液与白色念珠菌加入RPMI-1640反应液中(终浓度均为1×106cfu·mL－1)，总体积为100 μL，混匀后置于37℃水浴。(3)水浴2 h后取出孵浴液50 μL，加生理盐水450 μL，连续10倍稀释，共4次。每1倍数稀释液都取出100 μL的稀释液至无菌培养皿(直径55 mm)中，再加入经高温消毒后50℃保温的沙保罗氏琼脂培养基5 mL，待琼脂冷却后，将培养皿放入约37℃温箱培养，72 h后取出并计算白色念珠菌菌落数，与未加入上清液/渗出液/细胞液的空白对照比较，计算不同浓度上清液的杀菌率(杀菌率＝(空白对照组白色念珠菌数－各浓度白色念珠菌数)/空白对照组白色念珠菌数×100%)。

2.4 上清液对真菌的杀菌作用[4]

计算20%、4%、0.8%上清液对白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌的杀菌率，除“(2)离心收集白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌，将上清液与白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌加入RPMI-1640反应液”外，其余操作同“2.3”项。

2.5 温度对上清液杀菌作用的影响

取上清液制备成含20%上清液的反应体系，分别在36、56℃水浴10 min，然后按“2.3”项下方法对白色念珠菌做杀菌试验。

2.6 上清液对白色念珠菌的杀灭过程

根据文献[6]方法，取上清液制备成含80%上清液的反应体系，在37℃、40倍显微镜下，分别观察作用前和作用30、120 min时白色念珠菌菌体形态的变化，并照相记录。

2.7 统计学分析

应用SPSS11.0软件进行统计处理，计量资料以±s表示，采用方差分析，P＜0.05表示具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠腹腔渗出液比较

正常对照组大鼠注射生理盐水12 h后，生理盐水被腹腔几乎完全吸收，因此12 h以后收集不到渗出液，为对照观察模型组渗出液的情况，笔者用300 μL生理盐水冲洗腹腔，然后收集冲洗液，作为正常对照组渗出液，但在杀菌试验中不设此正常对照组。模型组大鼠给药24 h有大量渗出液渗出，有大量白细胞渗出，上清液中含有大量蛋白，结果见表1。

表1 各组大鼠腹腔渗出液的量、白细胞浓度和蛋白含量比较(±s，n＝8)Tab 1Comparison of the content of peritoneal exudates，the concentration of white cell and protein in peritoneal exudates in rat(s±s，n＝8)

表1 各组大鼠腹腔渗出液的量、白细胞浓度和蛋白含量比较(±s，n＝8)Tab 1Comparison of the content of peritoneal exudates，the concentration of white cell and protein in peritoneal exudates in rat(s±s，n＝8)

与正常对照组比较:＊P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.01

蛋白含量/mg·mL－1 5.41±0.85＊1.62±0.21组别模型组正常对照组渗出液的量/mL 3900.0±580.8＊270.5±55.5白细胞浓度/×106个·mL－1 35.0±4.0＊2.0±0.7

3.2 渗出液、上清液和细胞液对白色念珠菌的杀菌作用

渗出液、上清液和细胞液对白色念珠菌都有不同程度的杀菌作用，其中渗出液最强，在0.8%(V/V)时，与上清液或细胞液比较，杀菌作用明显更强(P＜0.01)；上清液与细胞液对白色念珠菌的杀菌作用比较没有显著性差异(P＞0.05)，结果见表2。

表2 渗出液、上清液和细胞液对白色念珠菌的杀菌作用比较(±s，n＝8)Tab 2Antifungal activity of peritoneal exudates，supernatant against Candida albican(sx ±s，n＝8)

表2 渗出液、上清液和细胞液对白色念珠菌的杀菌作用比较(±s，n＝8)Tab 2Antifungal activity of peritoneal exudates，supernatant against Candida albican(sx ±s，n＝8)

与相应浓度渗出液比较:＊P＜0.01vs.exudates with same concentration:＊P＜0.01

样本类型渗出液上清液细胞液杀菌率/%0.8%(V/V)63.74±9.7634.19±8.70＊36.90±7.75＊20%(V/V)98.47±1.5297.35±1.3896.83±2.894%(V/V)93.46±5.8389.75±8.7886.12±9.93

3.3 上清液对真菌的杀菌作用

模型组大鼠的上清液对白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌有很强的杀菌作用，反应体系含20%的上清液时，上清液的杀菌率都在93%以上；当上清液被稀释25倍(4%)后，上清液的杀菌率仍在60%以上，具体结果见表3。

表3 不同浓度的上清液对真菌的杀菌作用比较(±s，n＝8)Tab 3Comparison of antifungal activity of peritoneal exudates supernatant on fungu(s±s，n＝8)

表3 不同浓度的上清液对真菌的杀菌作用比较(±s，n＝8)Tab 3Comparison of antifungal activity of peritoneal exudates supernatant on fungu(s±s，n＝8)

0.8%上清液34.19±8.7025.19±11.4229.85±12.36菌种白色念珠菌光滑念珠菌热带念珠菌杀菌率/%20%上清液97.35±1.3893.42±5.1698.61±1.044%上清液69.75±8.7860.90±10.5463.40±8.86

3.4 温度对上清液杀菌作用的影响

含20%上清液的反应体系经过56℃水浴10 min后，对白色念珠菌的杀菌作用由36℃水浴的(97.35±1.38)%下降到(8.71±3.42)%，杀菌作用几乎完全丧失。提示上清液中的抗真菌物质对热不稳定。

3.5 上清液对白色念珠菌的杀灭过程

镜下观察表明，上清液作用前，白色念珠菌形态正常，胞体椭圆形；作用30 min后，白色念珠菌菌体逐渐变小，胞壁渐模糊；作用120 min后，白色念珠菌菌体破碎成碎片，大部分已死亡。上清液作用前、后白色念珠菌菌体的形态变化见图1。

4 讨论

大鼠腹腔受到细菌性感染刺激以后，产生免疫应答，引起感染的部位血管通透性升高，血流动力学改变，炎症细胞渗出，血浆渗入腹腔，产生大量腹腔渗出液，其上清液中含有大量蛋白。上清液对常见的致病真菌如白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌均有很强的杀菌作用，且杀菌作用受温度的影响，56℃可使其几乎完全丧失对真菌的杀菌作用。上清液对白色念珠菌作用后，白色念珠菌菌体缩小，最后菌体破碎而死亡。这提示，上清液中存在强抗真菌物质，且其抗真菌作用受到温度的影响；其对真菌所具有的强杀菌作用的机制可能是通过影响微生物细胞壁/细胞膜的直接作用，改变其通透性，造成其物理性损伤，导致细胞内容物外渗而死亡。

目前，生物体内已知有抗菌作用的蛋白有乳铁蛋白(LF)、组织蛋白酶G、防御素、磷脂酶A2等。LF首先由Groves在1960年从牛乳中分离获得。其在酸性条件下非常稳定，在pH值为4.0、温度为90℃加热处理5 min，抗菌作用保持不变。因此，56℃温度对于其对白色念珠菌的杀菌作用的影响不是很大。组织蛋白酶G对真菌的杀菌作用在56℃不受影响。防御素是广泛分布于动物和植物界的一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗微生物肽。研究表明，大鼠的防御素和人的防御素一样对白色念珠菌没有杀菌作用，而且其是小分子多肽，对热也很稳定。磷脂酶A2对革兰阳性细菌具有极强的杀菌作用[7]，但是笔者同期研究表明，磷脂酶A2对白色念珠菌没有杀菌作用。因此，上清液中的抗真菌物质是已知的几种抗真菌蛋白的可能性很小，这就提示腹腔渗出液中存在着未知的抗真菌物质，很有可能是分子量比较大、对热不稳定的蛋白。

上清液中抗菌蛋白/肽，其来源及性质、肽链的结构和性质能否人工改造或合成，很值得进一步研究，这也为天然抗真菌药物的开发提供了思路。

[1]周捷，余江平.我院2005－2006年519例真菌耐药性分析[J].中国药房，2008，19(14):1081.

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[6]Edwards SW.Biochemistry and Physiology of the Neutrophil[M].Cambridge:Cambridge University，1994:68.

[7]梁宁生，李艳，杨帆，等.重组人血小板型磷脂酶A2杀菌作用的研究[J].中华医院感染学杂志，2004，14(10):1081.